UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
yellow kemungkinan akan dipecah oleh reduksi azo-usus. Urin juga didominasi produk azo-reduksi sulphanilic asam, asam 1-amino-2-
naftol-6-sulfonat, dan bentuk bentuk N-asetilasi Anonim, 2009 Beberapa penelitian mencatat adanya kandungan amina
aromatik unsulphonated didalam pewarna Sunset yellow dengan konsentrasi sampai 100 mg kg. Meskipun beberapa amina aromatik
mungkin terkait dengan genotoxicity atau bahkan carcinogenicity, peneliti mencatat bahwa Sunset yellow menunjukkan hasil yang
negatif pada genotoxicity secara in vitro juga seperti dalam studi carcinogenicity jangka panjang. Peneliti menyimpulkan bahwa
potensi genotoxicity Sunset yellow telah sepenuhnya diteliti baik secara in vitro dan in vivo, dan tidak ada indikasi adanya potensi
genotoksik pada pewarna Sunset yellow atau metabolitnya Anonim, 2009.
Sebuah penelitian McCann et al melakukan uji pada bahan tambahan makanan menyimpulkan bahwa paparan dalam makanan
untuk dua campuran dari empat warna sintetik ditambah pengawet natrium benzoat, Mix A dan Mix B, keduanya mengandung Sunset
yellow mengakibatkan hiperaktif meningkat pada umur 3 tahun, 8 tahun dan anak-anak yang berusia 9 tahun pada populasi. Anonim,
2009. Batas normal pewarna Sunset yellow yang diizinkan oleh
Pemerintah Indonesia berdasarkan Peraturan Menteri Kesehatan RI Nomor :722MEN.KES.PERIX88 Tentang Bahan Tambahan
Makanan adalah 70 µgmL produk siap dikonsumsi untuk minuman dan makanan cair Departemen Kesehatan RI, 1988. Sedangkan
berdasarkan WHO adalah ADI 0 – 2,5 mgkg. Sedangkan LD
50
dari Sunset yellow 5000mgKg pada tikus Anonim, 2008.
2.3 Minuman sirup
Menurut Departemen Perindustrian 1977 sirup ialah minumam gula sakrosa pekat yang dipergunakan sebagai bahan minuman dengan tanpa
ditambahkan asam antara lain asam sitrat, asam tartrat atau asam laktat, juga
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
aroma dan zat warna. Sirup dapat dibuat dari gula alami tebu dan bit dan gula sintetik sakarin, siklamat, aspartam dan sorbitol. Hubies, dkk., 1994.
Sirup dikatakan baik jika larutannya kental alami tanpa penambahan pengental, mempunyai rasa manis alami, diolah dan dikemas secara aseptik
dan mempunyai warna yang baik menggunakan pewarna makanan food colour Hubies, dkk., 1994.
Komponen utama pembuatan sirup antara lain gula alami: sukrosa, glukosa dan fruktosa. Sedangakan sintetik: sorbitol, aspartam dan sakarin,
pewarna, flavor dan air. Bahan aditif seperti asam sitrat dan CMC tetapi tidak selalu digunakan tergantung kebutuhan Hubies, dkk., 1994.
Cara pembuatan sirup yaitu dengan cara: a. Memilih buah yang telah tua, segar dan yang masak kemudian dicuci,
b. Buah dipotong menjadi 4 bagian, c. Buah diparut hingga menjadi bubur,
d. Ditambahkan air, gula pasir, natrium benzoat, asam sitrat dan garam dapur,
e. Diaduk sampai rata, f. Campuran dipanaskan hingga mendidih dan biarkan sampai agak
mengental, g. Dalam keadaan panas disaring kemudian didinginkan setelah dingin
segera dimasukkan kedalam botol Margono, dkk., 2000
2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT atau juga biasanya disebut dengan HPLC High Performance Liquid Chromatograhpy dikembangkan
pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian
senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri - industri makanan
Rohman dan Gandjar, 2007. Kegunaan umum KCKT adalah untuk: pemisahan sejumlah senyawa
organik, anorganik, maupun senyawa biologis; analisis ketidakmurnian
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
impurities; analisis senyawa – senyawa yang tidak mudah menguap non -
volatil; penentuan molekul – molekul netral, ionik maupun zwitter ion;
pemisahan senyawa – semyawa yang strukturnya hampir sama dan lain- lain.
KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif Rohman dan Gandjar, 2007.
Keuntungan KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain kolom bisa digunakan kembali dan cepat:
waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
uncomplicated, waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai Putra, 2004. Keterbatasan metode KCKT adalah jika digunakan untuk identifikasi
senyawa harus menggunakan standar atau pembanding, kecuali jika KCKT dihubungkan dengan spektrofotometer massa MS Rohman dan Gandjar,
2007.
2.4.1 Cara kerja KCKT
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat – zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan zat terlarut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan zat terlarut ini diatur oleh
distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam. Penggunaan kromatografi cair secara luas terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan
penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom, dan ukuran sampel
Rohman dan Gandjar, 2007. Untuk memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik, maka
dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam faktor yang mempengaruhi pemisahan kromatografi cair Rohman dan Gandjar,
2007.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4.2 Komponen instrument KCKT
Instrument KCKT pada dasarnya terdiri dari beberapa komponen pokok, yaitu pompa, injektor, guard kolom, kolom, detektor, perekam
rekorder dan integrator. Rekorder
Pompa kolom
Gambar 3. Diagram Alir Alat KCKT Anonim, 2007 a. Pompa
Pompa digunakan untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Syarat pompa yang baik untuk KCKT yaitu pompa harus inert terhadap fase gerak, mampu memberikan tekanan sampai 5000psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mLmenit. Bahan yang umum yang dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karet, teflon,
dan batu nilam Rohman dan Gandjar, 2007. b. Injektor
Kegunaan injektor adalah tempat untuk memasukkan sampel – sampel
cair atau larutan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom Rohman dan Gandjar, 2007.
c. Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen
sampel di dalam kolom analisis kualitatif dan menghitung kadamya analisis kuantitatif.Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi,
Pelarut
Injektor Detektor
Limbah pelarut
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gangguan noise yang rendah, respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Sensitifitas yang rendah terhadap
aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh Putra, 2004.
Adapun jenis detektor pada KCKT yang sering digunakan antara lain: Detektor Spektrofotometri UV-Vis
Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet UV dan sinar tampak Vis pada kisaran panjang gelombang 190
– 800 nm Rohman dan Gandjar, 2007.
Detektor Fluoresensi Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika
suatu senyawa menyerap sinar UV atau visibel lalu mengemisikannya pada panjang gelombang yang lebih besar. Keunggulan dari detektor ini
adalah bahwa detektor ini lebih sensitif dan selektif. Sedangkan kelemahan dari detektor ini adalah terkait dengan rentang linieritasnya
yang sempit yakni antara 10 – 100 Rohman dan Gandjar, 2007.
Detektor indeks bias Detektor ini merupakan detektor yang bersifat universal yang
mampu memberikan respon signal pada setiap zat terlarut. Detektor ini akan merespon setiap perbedaan indeks bias antara analit zat
terlarut dengan pelarutnya fase gerak. Kelemahan utama detektor ini adalah bahwa ineks bias dipengaruhi oleh suhu, oleh karena itu suhu
fase gerak, kolom dan detektor harus dikendalikan secara seksama. Penggunaan detektor ini terutama untuk senyawa yang tidak memiliki
gugus kromofor Rohman dan Gandjar, 2007. d. Guard kolom
Guard kolom bertindak sebagai filter kimia untuk menahan material yang mungkin dapat merusak atau menyumbat kolom yang berakhir pada
memendeknya umur kolom. e. Kolom
Kolom merupakan jantung dari kromotografi karena berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
percobaan yang sesuai yang berfungsi untuk memisahkan masing –
masing komponen. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan
temperatur lebih tinggi Putra, 2004. f. Komputer, integrator, dan rekorder
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik
yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis
Rohman dan Gandjar, 2007.
2.4.3 Teknik pemisahan dalam KCKT
Sistem isokratik yaitu suatu teknik pemisahan dimana selama proses analisis berlangsung, fase gerak atau komposisi fase gerak tidak berubah
yang berarti polaritasnya juga tetap. Sedangkan sistem gradient adalah suatu teknik pemisahan dimana
selama analisis berlangsung komposisi fase gerak berubah secara periodik. Teknik ini dilakukan dengan tujuan memisahkan campuran dengan
polaritas yang sangat beragam.
2.4.4 Metode analisis dalam KCKT
Metode analisis KCKT dapat dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif merupakan cara yang terbaik adalah dengan
menggunakan metode waktu retensi :
Keterangan : t
Ri
= waktu retensi komponen zat t
Rst
= waktu retensi standar Data waktu retensi khas tetapi tidak spesifik, artinya terdapat lebih dari
satu komponen zat yang mempunyai waktu retensi yang sama Rohman dan Gandjar, 2007.
Analisis kuantitatif memiliki tahapan adalah sebagai berikut : membuat spektrum serapan komponen
– komponen yang ada dalam
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sampel, mencari panjang gelombang optimum untuk campuran komponen zat dalam sampel, dan mencari fase gerak yang sesuai agar komponen
– komponen tersebut terpisah Rohman dan Gandjar, 2007.
Dasar perhitungan kuantitatif untuk suatu komponen yang dianalisis adalah mengukur luas puncaknya. Ada beberapa metode yang dapat
digunakan, yaitu : a. Baku luar Baku eksternal
Metode kuntitatif yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu
sampel adalah dengan menggunakan plot kalibrasi menggunakan baku eksternal. Larutan
– larutan ini ditunjuk sebagai larutan eksternal karena larutan
– larutan ini disiapkan dan dianalisa secara terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada dalam sampel. Sampel yang
mengandung senyawa tertentu yang akan ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan, selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan
cara yang sama Rohman dan Gandjar, 2007. Senyawa atau senyawa-senyawa yang akan ditetapkan kadarnya,
idealnya jumlah baku sama dengan jumlah bahan yang akan dianalisis, selanjutnya membandingkan kromatogram baku dengan kromatogram
sampel Putra, 2004.
Keterangan : Cs = konsentrasi sampel
Cst = konsentrasi standar As = luas puncak sampel
Ast = luas puncak standar Bila bekerja dengan metoda ini, respons detektor harus linier
untuk setiap senyawa pada kisaran range konsentrasi yang digunakan, dan juga kita harus menginjeksikan bila secara manual
jumlah yang sama untuk setiap komponen pada kedua kromatografi, sehingga berhasilnya operasi dari metoda ini tergantung pada
kemampuan menginjeksi sampel dengan presisi yang bagus Putra, 2004.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
b. Baku dalam Baku internal Baku internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit,
meskipun demikian senyawa ini harus terpisah dengan baik selama proses pemisahan Rohman dan Gandjar, 2007.
Pada metode ini pada sampel ditambahkan zat tertentu konsentrasi
yang diketahui.
Kromatogram yang
diperoleh dibandingkan dengan kromatogram sampel atau campuran senyawa
dalam sampel Putra, 2004. Baku inetrnal dapat menghilangkan pengaruh karena adanya
perubahan – perubahan pada ukuran sampel atau konsentrasi karena
variasi instrumen Rohman dan Gandjar, 2007. Selain itu, metoda ini mempunyai keuntungan dibanding dengan metoda baku luar karena
metode ini mengkompensasi variasi volume injeksi dan juga untuk perubahan yang kecil dari sensitivitas detektor yang bisa terjadi
karena itu tidak perlu menginjeksi dalam jumlah yang sama setiap waktu, maka metoda ini biasanya mempunyai presisi yang lebih baik
dari pada menggunakan baku luar Putra, 2004.
2.5 Validasi metode
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. a. Uji kesesuaian Sistem
Sebelum digunakan sistem harus diuji terlebih dahulu agar dapat menjamin bahwa metode tersebut dapat menghasilkan akurasi dan
presisi yang dapat diterima. Parameter – parameter yang digunakan
meliputi bilangan lempeng teori N, resolusi, HETP height equivalent to a theoretical plate dan koefisien variasi KV atau simpangan data
relatif RSD Rohman dan Gandjar, 2007.
b. Akurasi kecermatan Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dinyatakan sebagai persen perolehan kembali recovery. Ada tiga cara untuk menentukan akurasi, yaitu metode perbandingan terhadap
standar acuan, metode simulasi atau spiked placebo recovery dan metode penambahan bahan baku atau standard addition method.
Persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil kadar yang diperoleh dengan kadar yang sebenarnya Harmita, 2004.
c. Presisi Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian
antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-
sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif atau koefisien
variasi 2 atau kurang Harmita, 2004. Keseksamaan
dapat dinyatakan
sebagai keterulangan
repeatability atau ketertiruan reproducibility. Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang
sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek. Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi
yang berbeda Harmita, 2004. d. Selektivitas spesifikasi
Selektivitas atau spesifisitas adalah suatu metode kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama
dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat
penyimpangan degree of bias metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran,
hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan. Pada metode analisis dengan kromatografi, selektivitas ditentukan melalui resolusinya Rs. Pemisahan kromatogram yang
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
baik diperoleh bila nilai resolusinya lebih besar dari 1,5 Harmita, 2004.
e. Linearitas dan rentang Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan
respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam
sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan
kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima Harmita, 2004.
f. Batas deteksi dan batas kuatitasi LOD dan LOQ Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji
batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih
dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dan
kurva. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan
simpangn baku residual Syx Harmita, 2004.
2.6 Teknik sampling
