29
kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselen yang telah dipijar dan ditara. Krus dipijar
perlahan-lahan sampai arang habis. Pijaran dilakukan pada suhu 500-600°C selama 3 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap.
Kadar dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara WHO, 1998.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit. Bagian yang tidak larut asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring, dipijarkan sampai bobot tetap, didinginkan dan ditimbang. Kadar dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
di udara Ditjen POM, 2000.
3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Titanus Secara Maserasi
Sebanyak 500 g simplisia dimasukkan kedalam wadah gelas berwarna gelap, dituangi 75 bagian cairan penyari etanol 96, ditutup, dibiarkan selama 5
hari dan terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, diperas dan dicuci ampas dengan cairan penyari secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Pindahkan
kedalam bejana tertutup dan terlindung dari cahaya selama 2 hari, enap tuangkan atau saring Ditjen POM, 1979. Filtrat diuapkan menggunakan rotary evaporator
pada temperatur 40 C sampai diperoleh ekstrak kental.
Universitas Sumatera Utara
30
3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas yang mempunyai presisi dan media
pertumbuhan bakteri disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit dan
alat-alat gelas lainnya disterilkan didalam oven pada suhu 170 C selama 1 jam.
Jarum ose dan pinset disterilkan dengan lampu bunsen Ditjen POM, 1995.
3.8 Pembuatan Media 3.8.1 Pembuatan media nutrient agar NA
Komposisi: Lab-lemco powder 1,0 g
Yeast extract 2,0 g
Peptone 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15 g
Cara Pembuatan: Sebanyak 28 g media nutrient agar ditimbang dan dimasukkan kedalam
erlenmeyer, kemudian ditambahkan air suling sebanyak 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut. Media nutrient agar disterilkan di dalam autoklaf pada suhu 121°C
selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.8.2 Pembuatan media nutrient broth NB
Komposisi: Lab lemco powder 1,0 g
Yeast extract 2,0 g
Peptone 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Cara Pembuatan:
Universitas Sumatera Utara
31
Sebanyak 13 g media nutrient broth yang sudah jadi ditimbang dan dilarutkan dengan air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut sempurna.
Media dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertututp dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 1982.
3.8.3 Pembuatan agar miring
Sebanyak 3 ml media nutrient agar cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diletakkan pada sudut kemiringan 30-45
o
C dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di lemari pendingin Lay, 1994.
3.9 Pembiakan Bakteri 3.9.1 Pembuatan stok kultur
3.9.1.1 Bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, dan Pseudomonas aeruginosa
Satu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanamkan pada media nutrient agar NA miring dengan
cara menggores, setelah itu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 C selama 18
jam Depkes RI, 1995. Pembuatan stok kultur bakteri Staphylococcus epidermidis, dan Pseudomonas aeruginosa sama dengan prosedur untuk bakteri
Staphylococcus aureus.
3.9.1.2 Peremajaan bakteri
Satu koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores. Kemudian diinkubasi
dalam inkubator pada suhu 36-37
o
C selama 18 jam. Peremajaan ini dilakukan sebanyak 3 kali Depkes, 1995.
3.9.1.3 Pembuatan larutan Standar McFarland No. 0,5
Universitas Sumatera Utara
32
Sebanyak 0,05 ml larutan BaCl
2
1 dicampur dengan 9,95 ml larutan H
2
SO
4
1 dan dikocok homogen. Larutan Standart McFarland No.0,5 ini setara dengan suspensi sel bakteri konsentrasi 10
8
CFUml Difco and BBL Manual, 2009.
3.9.2 Pembuatan inokulum 3.9.2.1 Bakteri Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, dan
Pseudomonas aeruginosa
Koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml larutan
nutrient broth NB, diinkubasi sampai didapat kekeruhan yang sama dengan larutan Standar Mc.Farland No.0,5, berarti konsentrasi bakteri adalah 10
8
CFUml. Kemudian dilakukan pengenceran suspensi bakteri dengan memipet 0,1 ml inokulum bakteri dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi larutan
nutrient broth NB sebanyak 9,9 ml dan divortex hingga homogen maka suspense bakteri konsentrasinya sama dengan 10
6
CFUml. Pembuatan inokulum bakteri Staphylococcus epidermidis, dan Pseudomonas aeruginosa sama dengan
prosedur untuk bakteri Staphylococcus aureusDifco and BBL Manual, 2009.
3.10 Pembuatan Larutan Uji dengan Berbagai Konsentrasi. 3.10.1 Ekstrak Etanol Daun Titanus
Cara kerja : Ekstrak etanol ditimbang 5 g, dilarutkan dengan dimetil sulfoksida
DMSO hingga 10 ml, sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak 500 mgml,
Universitas Sumatera Utara
33
kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 400, 300, 200, 100, 75, 50, 25, 6,25 dan 3,125 mgml.
3.10.2 Larutan Povidon Iodin
Povidon iodin 10 dipipet sebanyak 0,75 ml, dilarutkan dengan aquadest steril hingga 1 ml, divortex hingga homogen, sehingga diperoleh konsentrasi
povidon iodine 7,5, kemudian dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh povidon iodine dengan konsentrasi 5, 2,5, 1, 0,5 dan 0,25.
3.11 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Titanus dan Povidon Iodin
Metodeinimenggunakanmediapadatdanpencadang kertas berukuran 6 mm. Penentuan daya hambat pertumbuhan bakteri dilakukan dengan cara mengukur
diameter daerah jernih di sekeliling pencadang kertas menggunakan jangka sorong.
Cara kerja : Sebanyak 0,1 ml inokulum dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu
dituang media nutrient agar NA sebanyak 15 ml dengan suhu 45-50 C, lalu
dihomogenkan dengan cara cawan digoyang di atas permukaan meja agar media dan suspensi bakteri tercampur rata dan dibiarkan memadat. Pencadang kertas
yang telah ditetesi 0,1 ml larutan ekstrak etanol daun titanus atau povidon iodin dalam berbagai konsentrasi, diletakkan di atas media yang telah memadat,
dibiarkan 15 menit, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37
o
C selama 18 jam, setelah itu diukur diameter daerah hambatan zona jernih pertumbuhan di
sekitar pencadang dengan menggunakan jangka sorong.
Universitas Sumatera Utara
34
3.12 Pengujian Aktivitas Antibakteri Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Titanus dan Povidon Iodin
