Supernatan Endapan Dilarutkan dalam 0.25 sukrosa-10mM buffer
Tris-HCl-0.1 mM buffer EDTA Sitosol Fraksi mikrosomal
Gambar 5. Diagram alir fraksinasi sel
b. Pengukuran Kadar Protein, Metode Lowry Apriyantono, et al., 1989
Pada pengukuran protein dengan metode Lowry dibutuhkan pereaksi Natrium karbonat 2 dalam larutan NaOH 0.1N 1, tembaga
sulfat 0.5 dalam larutan NaK-Tartarat 1 2 dibuat hanya pada waktu akan digunakan. Kemudian dicampurkan 50 ml pereaksi pertama
dan 1 ml pereaksi ke dua 3 hanya stabil 1 hari. Dibutuhkan juga pereaksi folin dilarutkan dengan air 1 : 1, dan larutan protein standar
0.25 mgml BSA Bovine Serum Albumin.
Tabel 2. Persiapan analisa pengukuran kadar protein Tabung
Larutan protein standar 0.25 mgml Pereaksi 3
1 4 ml akuades blanko
5.5 ml 2
0.1 ml ditepatkan hingga 4 ml 5.5 ml
3 0.2 ml ditepatkan hingga 4 ml
5.5 ml 4
0.4 ml ditepatkan hingga 4 ml 5.5 ml
5 0.6 ml ditepatkan hingga 4 ml
5.5 ml 6
0.8 ml ditepatkan hingga 4 ml 5.5 ml
7 1.0 ml ditepatkan hingga 4 ml
5.5 ml 8
Sampel ditepatkan hingga 4 ml 5.5 ml
Analisis diawali dengan pembuatan larutan standar, disiapkan 8 tabung reaksi. Persiapan dapat dilihat pada Tabel 2. Setelah dibiarkan
selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian ditambahkan pereaksi folin 0.5 ml ke dalam masing-masing tabung, kocok merata dengan cepat dan
dibiarkan 30 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 650 nm dan dibuat kurva standar sehingga konsentrasi
larutan protein sampel dapat ditentukan. Disiapkan 8 seri tabung reaksi, 6 tabung berisi larutan standar BSA
dengan konsenterasi tertentu, 1 tabung berisi sampel 0.1 ml dan satu tabung berisi blanko
Masing-masing tabung ditambahkan larutan Cu alkali 5.5 ml Didiamkan 10 menit lalu ditambahkan 0.5 ml pereaksi folin,
divorteks, didiamkan 30 menit Diukur absorbansi dengan
λ 650 nm
Gambar 6. Diagram alir pengukuran kadar protein c. Determinasi Kadar Sitokrom P-420 Omura dan Sato, 1964;
Opdycke, et al., 1982
Ke dalam masing-masing tabung tabung sampel dan baseline dimasukkan 2 ml fraksi mikrosomal dan ditambahkan 2 ml 0.1 M buffer
fosfat pH 7.6. Khusus untuk tabung sampel dialirkan 25 gelembung gas CO dengan kecepatan alir gas sebesar 1 gelembung per detik.
Setelah itu, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1-3 mg NaS
2
O
4
. Isi dari masing-masing tabung dituangkan ke kuvet dan diukur pada panjang gelombang 400-500 nm.
Tabung baseline Tabung sampel 2 ml fraksi mikrosomal
2 ml buffer fosfat pH 7.6 2 ml buffer fosfat pH 7.6 CO
1-3 mg Na
2
S
2
O
4
Dituang larutan ke dalam kuvet Diukur absorbansi pada λ 500-400 nm
Gambar 7. Diagram alir determinasi Kadar Sitokrom P-420 Perhitungan :
Kadar sitokrom P-420 = A
420
111 cm
–1
mM
–1
Kadar sitokrom = kadar sitokrom mmolml kadar protein mgml
d. Pengukuran Aktivitas Glutation S-Transferase Arisudana, 2003
