disentrifus kembali dengan kecepatan yang lebih tinggi dan waktu yang lebih lama, tahap ini bertujuan untuk mendapatkan supernatan fraksi
sitosol dan endapan akan menjadi fraksi mikrosomal. Tahap akhir untuk mendapatkan fraksi mikrosomal adalah
penambahan larutan sukrosa-buffer tris-buffer EDTA pada endapan. Setelah proses fraksinasi sel kemudian dilakukan pengukuran kadar protein metode
Lowry, pengukuran kadar sitokrom dan pengukuran aktivitas GSH. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap kadar protein hati
tikus untuk mengetahui jumlahkadar protein yang berasal dari fraksi sitosol dan mikrosomal. Kadar protein dari fraksi sitosol memiliki nilai yang jauh
lebih tinggi dibandingkan kadar protein dari fraksi mikrosomal baik dari kelompok tikus kontrol maupun kelompok perlakuan. Kandungan protein
dari fraksi sitosol tikus kelompok kontrol, Kk 1 dan Kk 2 berturut-turut adalah 62.221 mgml, 81.311 mgml dan 75.096 mgml sedangkan dari
fraksi mikrosomal berturut-turut dari kelompok kontrol, Kk1 dan Kk2 adalah 2.272 mgml, 0.974 mgml dan 1.447 mgml.
4. Kadar Sitokrom P-420
Penentuan kadar sitokrom pertama-tama dilakukan persiapan sampel hati dari fraksi mikrosomal. Disiapkan 2 tabung reaksi untuk penempatan
baseline dan sampel baseline berfungsi sebagai blanko. Setelah tabung baseline dan tabung sampel ditambahkan fraksi mikrosomal, kemudian
kedua tabung tersebut ditambahkan larutan buffer fosfat pH 7.6. Tabung sampel kemudian dialirkan gas CO untuk mengetahui seberapa besar sampel
tersebut tereduksi. Menurut Donatus 2001, Reaksi reduksi pada fase I dikatalisir oleh
sitokrom P-450 mikrosomal, berlangsung dengan efektif dalam kondisi tegangan oksigen yang rendah. Bila tidak demikian, tentunya oksigen
molekuler akan bersaing dengan substrat senyawa asing dalam proses perpindahan elektron yang dikatalisir oleh sistem enzim tersebut. Pada
proses reaksi ini, senyawa-senyawa yang berada dalam minuman seduhan
perlakuan dapat tereduksi menjadi anion radikal yang kemudian terbentuk radikal bebas karena pecahnya suatu ikatan.
Setelah dialirkan gas CO, kemudian sampel dan baseline ditambahkan sodium dithionit. Menurut Schenkman 1991, mikrosomal hati terdiri dari
pigmen heme protein yang memiliki kemampuan untuk berkombinasi dengan CO untuk memberikan serapan absorbansi pada panjang gelombang
450 nm. Mikrosomal akan tereduksi oleh penambahan sodium dithionit dan kemudian terkomplek dengan CO dan akan memperlihatkan puncak yang
khas pada panjang gelombang 450 nm. Telah diketahui bahwa sitokrom P450 merupakan sistem enzim yang
terikat pada membran fosfolipid, apabila ikatan dengan membran itu terlepas maka sistem P450 akan berubah menjadi bentuk yang tidak aktif yaitu
sitokrom P420.Bentuk sitokrom P420 lebih mudah larut dibandingkan dengan sitokrom P450.
Metabolit yang terbentuk pada fase I pada umumnya lebih polar daripada senyawa induknya atau berupa gugus yang reaktif bagi reaksi fase
II. Ada kalanya metabolit yang terbentuk bersifat kurang polar daripada senyawa induknya atau lebih toksik Donatus, 2001.
Pada penelitian tidak didapat absorbansi maksimum pada panjang gelombang 450 nm tetapi didapat absorbansi maksimum pada panjang
gelombang 420 nm. Substrat yang berikatan dengan grup heme pada enzim maka substrat tersebut akan menyebabkan panjang gelobang maksimum
terdapat pada 420 nm dan disebut sebagai substrat tipe II. Menurut Schenkman 1991, hemeprotein pada sitokrom P450
mempunyai sisi aktif pada putaran rendah dan putaran tinggi. Hemeprotein dengan putaran tinggi biasanya mempunyai absorbansi maksimum 390 nm
sedangkan hemeprotein dengan putaran rendah mempunyai absorbansi maksimum 420 nm. Molekul yang berinteraksi dengan sitokrom dalam
bentuk teroksidasi akan membentuk komplek enzim substrat dengan absorbansi 390 nm dan disebut tipe I.
Jadi sitokrom yang terdeteksi pada penelitian ini adalah yang bertipe II, yaitu yang berikatan dengan hemeprotein. Hal ini menunjukkan bahwa
komponen bioaktif pada minuman seduhan bubuk kumis kucing berinteraksi dengan hemeprotein dari enzim sitokrom P450.
Dari hasil pengamatan diketahui bahwa pemberian perlakuan pada tikus percobaan dengan sampel minuman seduhan bubuk daun kumis
kucing dapat mempengaruhi kerja hati atau menginduksi pada sistem enzim sitokrom P-450. Menurut Murray et al 1999, sitokrom P-450 bersifat
dapat terinduksi dan menyebabkan hipertrofi retikulum endoplasma halus, kemudian menimbulkan kenaikan jumlah sitokrom
Gambar 16. Grafik peningkatan kadar sitokrom P420 pada kelompok Kontrol, kelompok konsenterasi rendah dan kelompok
konsenterasi tinggi
Hal ini terlihat dari data yang didapatkan bahwa rata-rata kadar sitokrom kontrol 0.759 nmolmg protein lebih kecil dibandingkan rata-
rata kadar sitokrom dari hati tikus yang diberi perlakuan, yaitu sebesar 0.954 nmolmg protein untuk Kk1 dan 1.207 nmolmg protein untuk Kk2.
Jika dibandingkan antara kelompok kumis kucing perlakuan konsenterasi rendah dan konsenterasi tinggi, terlihat bahwa kelompok Kk2 lebih
menginduksi enzim sitokrom dari kelompok Kk1. Semakin tinggi konsenterasi minuman seduhan bubuk kumis kucing yang dikonsumsi oleh
0.759 0.954
1.207
0.2 0.4
0.6 0.8
1 1.2
1.4
kontrol Konsenterasi rendah
Konsenterasi tinggi
K ad
ar s it
ok ro
m
n m
olm g p
ro te
in
tikus percobaan maka dapat mempengaruhi kerja hati dengan cara menginduksi enzim sitokrom dalam hati.
5. Aktivitas Glutation S-Transferase GST
