BAB 3
BAHAN DAN METODA
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada bulan Oktober 2010 sampai Desember 2010 di Laboratorium Kultur Jaringan Departemen Biologi FMIPA USU. Pengamatan
mikroskopik akar dilakukan di Laboratorium Ilmu Dasar USU. Sedangkan bahan
tanaman berupa jeruk keprok Citrus nobilis Lour. berasal dari Jalan Kute Kreng,
Kecamatan Kute Lintang, Kabupaten Bener Meriah, Aceh.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, entkas, botol kultur, aluminium foil, pipet serologi, alat diseksi, gelas piala, gelas ukur, neraca analitik,
bunsen, erlenmeyer, cawan petri, pH meter, shaker, kertas saring, mikroskop, silet, gelas objek dan gelas penutup.
Bahan penelitian yang digunakan adalah embrio dari jeruk keprok Citrus
nobilis Lour., larutan pemutih NaOCl 5,25, benlate, tween 20, alkohol 70,
akuades, agar, gula, hara makro, hara mikro, myo inositol, vitamin, iron, BAP Benzyl Amino Purin, NAA Naftalen Asam Asetat dan ekstrak malt.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Metoda Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL non faktorial dengan perlakuan variasi konsentrasi BAP yang terdiri dari 5
taraf yaitu: B
= 0 ppm B
1
= 1 ppm B
2
= 2 ppm B
3
= 3 ppm B
4
= 4 ppm
Setiap perlakuan dibuat sebanyak 6 ulangan dan 4 pengamatan. Jumlah satuan botol kultur adalah 5 x 6 x 4 = 120 botol
3.4 Cara Kerja 3.4.1 Sterilisasi Alat
Semua gelas dan alat diseksi yang akan digunakan dicuci dengan bersih dan dikeringkan. Cawan petri yang telah bersih diisi dengan kertas saring. Kemudian alat-
alat tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C dengan tekanan 15 Psi selama 60 menit. Bersamaan dengan itu akuades dalam erlenmeyer yang telah ditutup
dengan aluminium foil juga ikut disterilisasi.
3.4.2 Pembuatan Media
Media yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog dengan penambahan NAA, ekstrak malt dan BAP dengan kosentrasi yang disesuaikan dengan perlakuan.
Tahap awal pembuatan media adalah pembuatan larutan stok, yang terdiri dari stok hara mikro, iron, vitamin dan zat pengatur tumbuh. Sementara unsur hara makro,
myo-inositol, sukrosa dan agar dapat ditimbang langsung sesuai kebutuhan tanpa harus dijadikan larutan stok.
Universitas Sumatera Utara
Larutan MS dibuat dengan memasukkan hara makro, myo-inositol dan sukrosa ke dalam gelas ukur 1000 ml. Selanjutnya hara mikro, iron, vitamin, sukrosa, 0,05
mgl NAA dan 500 mgl ekstrak malt juga dimasukkan ke dalam gelas ukur lalu ditambah akuades hingga 1000 ml, kemudian larutan dibagi menjadi 5 bagian sesuai
perlakuan. BAP dimasukkan untuk masing-masing perlakuan. Derajat keasaman pH larutan diukur setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter sebesar 5,8. Untuk
mendapatkan pH yang optimal maka ditambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N.
Tahap selanjutnya masing-masing larutan media dari tiap perlakuan dimasak sampai mendidih dengan menambahkan agar. Media dituang ke dalam botol-botol
kultur steril yang kemudian ditutup dengan aluminium foil steril dan diikat dengan karet gelang. Media disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121
o
C dan tekanan 15 Psi selama 15 menit. Botol yang berisi media yang telah disterilkan kemudian disimpan
dalam ruang kultur sebelum digunakan
.
3.4.3 Sterilisasi Bahan
Eksplan yang digunakan berupa embrio jeruk. Bahan tanaman berupa biji jeruk dibersihkan dibawah air mengalir selama 30 menit, dibilas dengan akuades steril.
Testa dilepaskan dari biji lalu direndam dalam benlate 0,2 gram100 ml yang ditambahkan 2 tetes tween 20 dan dishaker selama 2 jam. Selanjutnya biji tanpa testa
direndam dengan alkohol 70 selama 1 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Biji tanpa testa direndam dengan larutan pemutih 5 selama 5 menit, dibilas 3 kali
dengan akuades steril dan selanjutnya dengan larutan pemutih 2,5 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Selanjutnya biji tanpa testa diletakkan di dalam
cawan petri dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Embrio diambil dengan menggunakan pinset steril dari dalam biji.
a b
c d
Gambar 3.4.3 Bagian-bagian biji; a. Spermodermis Testa dan Tegmen; b. Inti biji Nukleus Seminis; c. Kotiledon; d. Embrio
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Penanaman eksplan
Sebelum melakukan penanaman ruangan harus dalam keadaan bersih. Penanaman dilakukan di dalam entkas yang telah disterilisasikan dengan sinar UV ultraviolet.
Alat-alat diseksi, lampu bunsen dan alkohol 70 dipersiapkan terlebih dahulu. Lampu bunsen digunakan untuk mencegah kontaminasi saat penanaman eksplan. Botol media
hanya diisi oleh satu eksplan embrio saja. Setelah tutup botol media dibuka, bagian sekitar mulut botol dilewatkan di atas api bunsen untuk memperkecil kontaminasi.
Eksplan yang telah disterilkan, diambil dari dalam cawan petri dan dimasukkan ke dalam botol kultur dengan menggunakan pinset steril. Botol kultur ditutup dengan
aluminium foil dan diikat dngan karet gelang.
a b
c Gambar 3.4.4 Alur kerja penanaman media; a. Media sebelum ditanam;
b. Proses penanaman; c. Media berisi eksplan embrio
3.4.5 Pemeliharaan Kultur
Eksplan yang telah ditanam di dalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan dengan kondisi ruangan yang steril, suhu berkisar 25
o
C. Intensitas cahaya yang digunakan dengan penyinaran lampu neon 500 lux. Botol-botol yang berisi eksplan
diatur posisinya sehingga memudahkan untuk pengamatan. Tiap kali pengamatan hendaknya tangan dan area tempat botol yang telah berisi eksplan disterilkan dengan
alkohol 70 untuk mengurangi terjadinya kontaminasi.
Universitas Sumatera Utara
3.4.6 Pengamatan Mikroskopik Akar
Akar berasal dari masing-masing perlakuan dan pengamatan setiap minggu. Akar yang akan diamati dibersihkan dari sisa-sisa media lalu diiris secara melintang dengan
menggunakan silet. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 4 x 10.
3.5. Variabel Pengamatan
Variabel yang diamati dalam penelitian ini pada tiap minggu adalah: a.
Persentase kultur yang hidup Jumlah eksplan yang tumbuh
Persentase kultur yang hidup = x 100
Jumlah eksplan seluruh perlakuan b.
Tipe pertumbuhan kultur c.
Berat planlet gram d.
Panjang tunas cm e.
Jumlah tunas buah f.
Jumlah daun helai g.
Panjang akar cm h.
Jumlah akar buah i.
Pengamatan mikroskopik akar planlet dengan objek preparat segar yang diambil dari tiap pengamatan interval pengambilan planlet 1 minggu
j. Persentase kontaminasi keseluruhan
Jumlah eksplan yang terkontaminasi Persentase terkontaminasi =
x 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan
Universitas Sumatera Utara
3.6 Analisis Data
Kategori