Pembuatan Media Sterilisasi Bahan

3.3 Metoda Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL non faktorial dengan perlakuan variasi konsentrasi BAP yang terdiri dari 5 taraf yaitu: B = 0 ppm B 1 = 1 ppm B 2 = 2 ppm B 3 = 3 ppm B 4 = 4 ppm Setiap perlakuan dibuat sebanyak 6 ulangan dan 4 pengamatan. Jumlah satuan botol kultur adalah 5 x 6 x 4 = 120 botol 3.4 Cara Kerja 3.4.1 Sterilisasi Alat Semua gelas dan alat diseksi yang akan digunakan dicuci dengan bersih dan dikeringkan. Cawan petri yang telah bersih diisi dengan kertas saring. Kemudian alat- alat tersebut disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 o C dengan tekanan 15 Psi selama 60 menit. Bersamaan dengan itu akuades dalam erlenmeyer yang telah ditutup dengan aluminium foil juga ikut disterilisasi.

3.4.2 Pembuatan Media

Media yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog dengan penambahan NAA, ekstrak malt dan BAP dengan kosentrasi yang disesuaikan dengan perlakuan. Tahap awal pembuatan media adalah pembuatan larutan stok, yang terdiri dari stok hara mikro, iron, vitamin dan zat pengatur tumbuh. Sementara unsur hara makro, myo-inositol, sukrosa dan agar dapat ditimbang langsung sesuai kebutuhan tanpa harus dijadikan larutan stok. Universitas Sumatera Utara Larutan MS dibuat dengan memasukkan hara makro, myo-inositol dan sukrosa ke dalam gelas ukur 1000 ml. Selanjutnya hara mikro, iron, vitamin, sukrosa, 0,05 mgl NAA dan 500 mgl ekstrak malt juga dimasukkan ke dalam gelas ukur lalu ditambah akuades hingga 1000 ml, kemudian larutan dibagi menjadi 5 bagian sesuai perlakuan. BAP dimasukkan untuk masing-masing perlakuan. Derajat keasaman pH larutan diukur setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter sebesar 5,8. Untuk mendapatkan pH yang optimal maka ditambahkan NaOH 0,1 N atau HCl 0,1 N. Tahap selanjutnya masing-masing larutan media dari tiap perlakuan dimasak sampai mendidih dengan menambahkan agar. Media dituang ke dalam botol-botol kultur steril yang kemudian ditutup dengan aluminium foil steril dan diikat dengan karet gelang. Media disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121 o C dan tekanan 15 Psi selama 15 menit. Botol yang berisi media yang telah disterilkan kemudian disimpan dalam ruang kultur sebelum digunakan .

3.4.3 Sterilisasi Bahan

Eksplan yang digunakan berupa embrio jeruk. Bahan tanaman berupa biji jeruk dibersihkan dibawah air mengalir selama 30 menit, dibilas dengan akuades steril. Testa dilepaskan dari biji lalu direndam dalam benlate 0,2 gram100 ml yang ditambahkan 2 tetes tween 20 dan dishaker selama 2 jam. Selanjutnya biji tanpa testa direndam dengan alkohol 70 selama 1 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Biji tanpa testa direndam dengan larutan pemutih 5 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril dan selanjutnya dengan larutan pemutih 2,5 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Selanjutnya biji tanpa testa diletakkan di dalam cawan petri dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Embrio diambil dengan menggunakan pinset steril dari dalam biji. a b c d Gambar 3.4.3 Bagian-bagian biji; a. Spermodermis Testa dan Tegmen; b. Inti biji Nukleus Seminis; c. Kotiledon; d. Embrio Universitas Sumatera Utara

3.4.4 Penanaman eksplan