Analisis Kimia Pengaruh Pengolahan Terhadap Profil Protein Dan Asam Amino Pada Keong Matah Merah (Cerithidea Obtusa)

3.4 Analisis Kimia

Analisis kimia pada keong matah merah terdiri dari analisis komposisi kimia, abu tak larut asam, asam amino, dan taurin. 3.4.1 Uji proksimat Uji proksimat merupakan pengujian yang dilakukan untuk menganalisis kadar air, kadar abu, kadar protein, dan kadar lemak pada suatu bahan pangan. 1 Analisis kadar air AOAC 2005 Penentuan kadar air didasarkan pada berat contoh sebelum dan sesudah dikeringkan. Cawan kosong dikeringkan di dalam oven selama ± 30 menit pada suhu 105 ˚C, lalu dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram dimasukkan ke dalam cawan lalu dikeringkan di dalam oven pada suhu 100-102 ˚C selama 6 jam atau sampai beratnya tetap konstan, kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit dan selanjutnya ditimbang kembali. Kadar air ditentukan dengan rumus: kadar air = x 100 Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan sampel gram C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan gram 2 Analisis kadar abu AOAC 2005 Cawan dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105 ˚C, lalu dimasukkan ke dalam desikator dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1-2 gram ditimbang lalu dimasukkan ke dalam cawan dan kemudian dibakar di atas kompor listrik diarangkan sampai tidak berasap lagi dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pengabuan 600 ˚C ± 6 jam. Cawan dimasukkan ke dalam desikator sampai dingin lalu ditimbang. Kadar abu ditentukan dengan rumus: kadar abu = x 100 Keterangan: A = Berat cawan abu porselen kosong gram B = Berat cawan abu porselen dengan sampel gram C = Berat cawan abu porselen dengan abu setelah dikeringkan gram 3 Analisis kadar protein AOAC 1995 Prinsip dari analisis protein yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar crude protein pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. a Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 1,8 – 3,2 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung kjeltec. Satu butir tablet kjeltec dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H 2 SO 4 . Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 ˚C ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. b Tahap destilasi Isi tabung dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan dengan akuades sebanyak 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40 sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 125 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 3 tetes indikator cairan methyl red dan brom cresol green yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 200 ml destilat yang bercampur dengan H 3 BO 3 dan indikator dalam erlenmenyer. c Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah warna menjadi pink. Perhitungan kadar protein adalah sebagai berikut: Protein = x 100 Keterangan: FP = Faktor pengenceran 4 Analisis kadar lemak AOAC 2005 Daging keong matah merah seberat 2 gram W 1 diletakkan di atas kapas bebas lemak lalu dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat kosongnya W 2 dan disambungkan dengan tabung sokhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung sokhlet dan disiram dengan pelarut lemak berupa n-heksana sebanyak 150 ml. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi sokhlet, kemudian dipanaskan pada suhu 40 ˚C dengan menggunakan pemanas listrik dan direfluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ˚C. Labu lemak yang telah dikeringkan kemudian dimasukkan ke dalam desikator hingga beratnya konstan lalu ditimbang W 3 . Perhitungan kadar lemak adalah sebagai berikut: Kadar Lemak = x 100 Keterangan : W 1 = Berat sampel gram W 2 = Berat labu lemak tanpa lemak gram W 3 = Berat labu lemak dengan lemak gram 3.4.2 Analisis kadar abu tak larut asam menurut SNI 01-3836-2000 BSN 2000 Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10 dan didihkan selama 5 menit. Larutan kemudian disaring dengan kertas saring Whatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida dengan pereaksi AgNO 3 . Kertas saring kemudian dikeringkan dalam oven. Kertas saring yang sudah dioven kemudian dilipat dengan menggunakan sudip dan diletakkan di dalam cawan porselen yang telah ditimbang bobotnya. Cawan tersebut dibakar di ruang asam sampai tidak berasap. Cawan kemudian dimasukkan dalam tanur selama 6 jam. Cawan lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar abu tak larut asam dapat ditentukan dengan rumus sebagai berikut: 3.4.3 Analisis asam amino AOAC 2005 dengan modifikasi Komposisi asam amino ditentukan menggunakan HPLC. Langkah pertama yang dilakukan adalah membilas perangkat HPLC dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Syringe yang akan digunakan juga dibilas dengan akuades. Analisis asam amino dengan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu 1 tahap pembuatan hidrolisat protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; dan 4 tahap injeksi serta analisis asam amino. 1 Tahap pembuatan hidrolisat protein Hal yang dilakukan pada tahap pembuatan hidrolisat protein adalah sampel ditimbang sebanyak 30 mg kemudian dihancurkan. Sampel yang telah hancur dihidrolisis asam menggunakan HCl 6 N sebanyak 2 ml yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 110 ˚C selama 24 jam. Pemanasan dalam oven dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. 2 Tahap pengeringan Sampel yang telah dihidrolisis pada suhu kamar dipindahkan isinya ke dalam labu evaporator 50 ml, dibilas dengan 2 ml HCl 0,01 N dan cairan bilasan dimasukkan ke dalam labu evaporator. Proses tersebut diulangi 2-3 kali. Sampel kemudian dikeringkan menggunakan rotary evaporator selama 15-30 menit untuk mengubah sistein menjadi sistin. Sampel yang sudah kering ditambah dengan 5 ml HCl 0,01 N kemudian disaring dengan kertas saring milipore. 3 Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi dibuat dengan menambahkan buffer kalium borat 1 M pH 10,4 pada sampel dengan perbandingan 1:1. Sebanyak 50 µl sampel ke dalam vial kosong yang bersih kemudian ditambahkan 250 µl pereaksi Ortoflaaldehida OPA dengan perbandingan 1:5, didiamkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung sempurna. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Larutan stok OPA dibuat dengan cara mencampurkan 50 mg OPA ke dalam 4 ml metanol dan 0,025 ml merkaptoetanol, dikocok perlahan dan tambahkan larutan brij 30 sebanyak 0,050 ml dan buffer kalium borat 1 M pH 10,4 sebanyak 1 ml. Larutan disimpan dalam botol berwarna gelap pada suhu 4 ˚C dan akan stabil selama 2 minggu. 4 Injeksi ke HPLC Larutan diinjeksikan sebanyak 5 µl ke dalam HPLC. Pemisahan asam amino dilakukan selama ±25 menit. Perhitungan konsentrasi asam amino yang ada pada bahan dilakukan dengan pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel. Kandungan asam amino dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus : Keterangan : BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gml Kondisi alat HPLC saat dilakukannya analisis asam amino adalah sebagai berikut: Temperatur : 27 ˚C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Ultra techspere Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan : 3000 psi Fase gerak : Buffer Na-Aaetat dan methanol 95 Detektor : Fluoresensi Panjang gelombang : 254 nm 3.4.4 Analisis kandungan taurin AOAC 1999 Kandungan taurin dapat dianalisis menggunakan alat HPLC dengan beberapa tahapan sebagai berikut : Sampel ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke labu ukur 100 ml, kemudian ditambah 80 ml air suling dan 1 ml pereaksi Carrez 1 lalu dikocok hingga homogen. Sampel yang telah homogen kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi Carrez 2, kemudian kocok hingga homogen. Sampel yang telah ditambahkan pereaksi Carrez 1 dan 2 kemudian dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan air suling sampai tanda tera labu ukur dan kocok hingga homogen. Sampel disaring menggunakan kertas saring Whatman. Filtrat ditampung dengan erlenmeyer dan disimpan ditempat gelap. Tahap selanjutnya adalah tahap derivatisasi yaitu dengan mengambil 10 ml ekstrak sampel dimasukkan ke labu ukur 10 ml, kemudian ditambahkan 1 ml buffer natrium karbonat dan 1 ml larutan dansil klorida. Sampel didiamkan selama 2 jam lalu dikocok dan ditambahkan 0,5 ml larutan metilamin hidroklorida dan air suling sampai tanda tera 10 ml, kemudian dikocok kembali hingga homogen. Hasil derivatisasi diambil sebanyak 20 µl kemudian diinjeksikan ke HPLC untuk mengetahui kandungan taurin pada sampel. Kandungan taurin dalam 100 gram bahan dapat dihitung dengan rumus : taurin = Keterangan : C = Konsentrasi standar taurin Kondisi alat HPLC saat analisis taurin adalah sebagai berikut : Temperatur : 27 ˚C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Pico tag 3,9x150 nm column Kecepatan alir eluen : 1,5 mlmenit Tekanan : 3000 psi Fase gerak : Asetonitril 60 dan buffer natrium asetat 1 M Detektor : UV Panjang gelombang : 272 nm

3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Steel dan Torrie 1993