Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditimbang dan ditambah metanol p.a hingga 10 ml.
e. Pembuatan larutan seri
Diambil 0,5; 1,0; 1,5; 2, dan 2,5 larutan stok rutin dan diencerkan dengan metanol p.a hingga 25 mL pada labu ukur, sehingga akan diperoleh larutan dengan
konsentrasi 5; 10; 15; 20; 25 gml.
f. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak biji trembesi
Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 25 ml dan didapatkan konsentrasi 1 mg ml. Dari larutan tersebut diambil
sebanyak 1; 2; 3; 4 dan 5 ml lalu di add dengan metanol p.a hingga 10 ml sehingga didapat konsentrasi 100; 200; 3000; 400; 500
gml.
6. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 ml larutan uji 100 0 gml dan larutan pembanding asam galat
120 gml dimasukkan masing-masing dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 1:10 vv. Larutan
tersebut kemudian ditambah dengan 7,5 ml natrium bikarbonat 1 M. Setelah 10 menit warna larutan diamati.
b. Uji pendahuluan aktvitas antioksidan
Sebanyak 1 ml larutan DPPH dimasukkan dalam masing-masing 3 tabung reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi kemudian ditambahakan dengan 1ml
metanol p.a sebagai kontrol, larutan pembanding rutinkonsentrasi 15 µgml, dan
larutan uji konsentrasi 120 µgml. Selanjutnya diencerkan dengan 3 ml metanol p.a. Larutan tersebut divortex 30 detik. Setelah 30 menit diamati perubahan warna yang
terjadi.
7. Optimasi metode penentuan kandungan fenolik total
a. Penentuan OT Operating Time Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml dan
masing-masing larutan diambil 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen Folin- Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 1:1. Kemudian larutan tersebut
ditambah dengan 4 mL larutan natrium bikarbonat 1 M. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Pengerjaan dilakukan 3 kali replikasi.
Operating time tercapai ketika absorbansi larutan telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml
dan masing-masing diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:1 kemudian larutan ditambah 4 ml
larutan natrium karbonat 1M. Didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; 80; 100; dan 120 µgml
ditambah dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10
vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat1M. larutan didiamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum
terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. 1:1, reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi CV,
linieritas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 1000 µgmL, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku
asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per gram fraksi air. Dilakukan 3 kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
