22
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan termasuk eksperimental dengan rancangan acak sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi.
2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik biji
trembesi. 3.
Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur tanaman, dan cara panen.
4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, iklim dan cuaca.
C. Definisi Operasional
1. Ekstrak etanolik biji trembesi adalah sari hasil proses maserasi biji trembesi
dengan penyari etanol 70 . 2.
Fraksi air adalah hasil fraksi ekstrak etanolik biji trembesi dengan menggunakan air yang telah difraksinasi menggunakan washbensin dan etil asetat.
3. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi untuk menangkap radikal DPPH.
4. Inhibition concentration 50 IC
50
adalah nilai konsentrasi fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi yang menghasilkan penangkapan 50 radikal DPPH.
D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: biji trembesi Samanea saman Jacq. Merr
yang terdapat di taman Universitas Sanata Dharma, kampus III, Paingan Yogyakarta; akuades Laboratorium Kimia Analisis Instrumental
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma; bahan kualitas p.a. E. Merck, yaitu: metanol, bahan kualitas p.a. Sigma Chem. Co., USA, yaitu: DPPH, reagen Folin-
Ciocalteu, asam galat, dan rutin; bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu: wasbensin dan etil asetat; bahan kualitas teknis CV. General Laboratorium, yaitu:
etanol 70; dan aluminium foil.
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, vacuum rotary evaporator Junke Kunkel, waterbath labo-tech,
Heraeus, vortex Janke Kunkel, spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20, blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-
1000 L; 1-10 mL Acura 825, Socorex, tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di
laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.
E. Tata Cara Penelitian 1.
Determinasi tanaman
Determinasi tanaman trembesi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi USD menurut Plantamor dan Ntbg 2013.
2. Pengumpulan bahan
Tanaman trembesi diperoleh dari koleksi tanaman milik Universitas Sanata Dharma. Pengambilan biji dengan kriteria berwarna hitam.
3. Preparasi sampel
Buah trembesi dikupas dan biji dipisahkan dari daging buahnya kemudian bijinya dibersihkan dengan air mengalir lalu dikeringkan di bawah sinar matahari dengan
ditutupi kain hitam. Sampel kemudian diblender untuk mengecilkan ukuran partikel. 4. Pembuatan fraksi air
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 30 g dan dituang kedalam bejana maserasi, ditambah etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur
homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi
dengan etanol secukupnya selama 2 hari, kemudian disaring. Lalu filtrat diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstak etanol biji trembesi.
Ekstrak etanol biji trembesi ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi cair- cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak wasbensin 1:1
vv, kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas.
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan
perbandingan larutan fraksi air-etil asetat 1:1 vv sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan dengan vacum rotary evaporator
hingga didapakan ekstrak kental. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan DPPH,pembanding dan uji
a. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10 mg fraksi air ditimbang, kemudian diencerkan dengan metanol p.a sampai 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 100
0 gml. b.
Pembuatan larutan asam galat Sebanyak 25 mg asam galat ditimbang dan diencerkan dengan metanol p.a :
aquadest 1:1 sampai 50 ml sehinggga didapatkan konsentrasi 500 gml. Diambil sebanyak 2; 3; 4; 5; 6 ml larutan tersebut kemudian diencerkan dengan metanol p.a :
aquadest 1:1 hingga 25 ml kemudian akan diperoleh larutan asam galat dengan konsentrasi 40; 60; 80; 100; 120 gml.
c. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil
dan dibuat selalu baru. d.
Pembuatan larutan stok rutin
Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditimbang dan ditambah metanol p.a hingga 10 ml.
e. Pembuatan larutan seri
Diambil 0,5; 1,0; 1,5; 2, dan 2,5 larutan stok rutin dan diencerkan dengan metanol p.a hingga 25 mL pada labu ukur, sehingga akan diperoleh larutan dengan
konsentrasi 5; 10; 15; 20; 25 gml.
f. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak biji trembesi
Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 25 ml dan didapatkan konsentrasi 1 mg ml. Dari larutan tersebut diambil
sebanyak 1; 2; 3; 4 dan 5 ml lalu di add dengan metanol p.a hingga 10 ml sehingga didapat konsentrasi 100; 200; 3000; 400; 500
gml.
6. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 ml larutan uji 100 0 gml dan larutan pembanding asam galat
120 gml dimasukkan masing-masing dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 1:10 vv. Larutan
tersebut kemudian ditambah dengan 7,5 ml natrium bikarbonat 1 M. Setelah 10 menit warna larutan diamati.
b. Uji pendahuluan aktvitas antioksidan
Sebanyak 1 ml larutan DPPH dimasukkan dalam masing-masing 3 tabung reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi kemudian ditambahakan dengan 1ml
metanol p.a sebagai kontrol, larutan pembanding rutinkonsentrasi 15 µgml, dan
larutan uji konsentrasi 120 µgml. Selanjutnya diencerkan dengan 3 ml metanol p.a. Larutan tersebut divortex 30 detik. Setelah 30 menit diamati perubahan warna yang
terjadi.
7. Optimasi metode penentuan kandungan fenolik total
a. Penentuan OT Operating Time Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml dan
masing-masing larutan diambil 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen Folin- Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest 1:1. Kemudian larutan tersebut
ditambah dengan 4 mL larutan natrium bikarbonat 1 M. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Pengerjaan dilakukan 3 kali replikasi.
Operating time tercapai ketika absorbansi larutan telah stabil.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 40; 80; dan 120 µgml
dan masing-masing diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:1 kemudian larutan ditambah 4 ml
larutan natrium karbonat 1M. Didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; 80; 100; dan 120 µgml
ditambah dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10
vv. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat1M. larutan didiamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum
terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. 1:1, reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi CV,
linieritas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 1000 µgmL, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku
asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per gram fraksi air. Dilakukan 3 kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang maksimum Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing- masing 0,4; 1,2; dan 2 ml
larutan DPPH 0,4 mM. Tiap labu ukur tersebut ditambah metanol p.a hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi DPPH sebesar0,016; 0,048; dan 0,080 mM.
Larutan tersebut divortex 30 detik. Larutan kemudian didiamkan selama 30 menit. Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometer visible pada
panjang gelombang antara 400-600 nm. b. Penentuan OTOperating Time
Sejumlah larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu ukur sebanyak 3 buah berukuran 5 ml.Kemudian masing-masing labu ukur ditambahkan dengan 1
ml larutan pembanding rutin 5; 15; dan 25 µgml kemudian ditambah metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca
absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang hasil pengukuran selama 1 jam. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari
larutan uji fraksi fraksi air pada konsentrasi 100, 300, dan 500 µgml.
10. Pengujian aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol Pada labu takar 5,0 ml, dimasukkan sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM
kemudian ditambah metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-
masing labu ukur 5,0 ml kemudian ditambah dengan 1,0 ml larutan pembandingan 5; 10; 15; 20; 25 gml dan larutan uji 100; 200; 300; 400; 500 gml. Selanjutnya
tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter presisi
RSD, linieritas nilai r serta spesifisitas spektra kontrol. d. Prosedur 8 a dan b kemudian dihitung IC dan IC
50
untuk rutin dan fraksi air ekstrak etanol biji trembesi.
F. Analisis hasil
Kandungan fenolik total dalam fraksi air ekstrak etanol biji trembesi dihitung sebagai massa ekivalen asam galat per gram fraksi air. Nilai absorbansi
larutan uji dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku asam galat sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutan uji terhadap asam galat. Kemudian dilakukan
perhitungan lebih lanjut berdasarkan rumus di bawah. Kandungan fenolik total =
�
�
Aktivitas penangkapan radikal DPPH IC dihitung dengan rumus : IC =
−
100 Data aktivitas dianalisis dan dihitung nilai IC
50
melalui persamaan regresi linier dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun larutan
pembanding dan y adalah IC. Untuk menentukan ada atau tidaknya perbedaan bermakna antara IC
50
antara larutan pembanding dan larutan uji kemudian dilakukan analisis statistik.
31
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitin sesuai dengan pustaka dan menghindari kekeliruan dalam
pengambilan bahan penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta,
pada tanggal 4 September 2013 berdasarkan acuan dari Plantamor dan Ntbg 2013. Hasil lampiran 1 determinasi menunjukkan bahwa memang benar tanaman yang
digunakan adalah Samanea saman Jacq. Merr. B.
Pengumpulan Bahan
Bahan biji trembesi diperoleh pada tanggal 23 November 2012 dari tanaman inventaris milik Universitas Sanata Dharma, Kampus III, Paingan,
Yogyakarta. Tanaman yang digunakan merupakan tanaman yang sengaja ditanam dilingkungan Kampus III, Universitas Sanata Dharma, Paingan, Yogyakarta yang
berfungsi sebagai penyerapan karbon dioksida, suasana menjadi teduh dan asri. Pemilihan sumber tanaman dengan tumbuhan trembesi didalam lingkungan kampus
Universitas Sanata Dharma dan mudah ditemukan serta dirawat secara khusus sebagai tanaman taman. Selain itu, spesies tanaman lebih mudah dipastikan karena
telah terdaftar pada bagian rumah tangga kampus Universitas Sanata Dharma.
Kategori