dan dapat digunakan untuk menguji antioksidan hidrofilik maupun lipofilik Kedare and Singh, 2011.
Uji penangkapan radikal DPPH mempunyai beberapa keterbatasan antaranya, radikal DPPH dapat berinteraksi dengan radikal lain dan kurva respons untuk
mencapai kondisi tidak linier dengan rasio antioksidanDPPH yang berbeda. Selain itu DPPH sensitif terhadap basa lewis dan solven seperti oksigen. Absorbansi DPPH
dalam metanol dan aseton menurun dibawah sinar matahari. DPPH juga memiliki keterbatasan dalam hal merefleksikan antioksidan dalam sistem emulsi dan tidak
bermanfaat untuk mengukur antioksidan Kedare and Singh, 2011.
E. Spektrofotometri
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan atau direflesikan sebagai fungsi dari panjang gelombang Khopkar, 2002.
Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk
mengukur perbedaan absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding Khopkar, 2002.
F. Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penarikan komponen atau zat aktif suatu simplisia dengan dengan pelarut tertentu. Faktor yang menjadi pertimbangan dalam memilih
metode esktraksi adalah sifat jaringan tanaman, sifat kandungan zat aktif serta kelarutan zat aktif dalam pelarut yang digunakan. Secara umum, ekstraksi secara
berturut-turut mulai dari dengan pelarut non polar , kepolarannya menegah kemudian pelarut polar Depkes RI, 2000. Pada saat ekstraksi terjadi perpisahan massa
komponen atau zat aktif dalam tanaman dari dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga terlarut dalam cairan penyari tersebut. Pada umumnya penyarian
akan bertambah baik bila permukaan serbuk simplisia yang bersentuh dengan penyari semakin luas Harborne, 1987.
Perbedaan stuktur kimia dari bahan akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa-senyawa tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat
dan derajat keasaman. Pengetahuan mengenai kandungan senyawa aktif dalam simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi secara tepat
Depkes RI, 2000. Pelarut yang baik mempunyai persyaratan antara lain murah, non toksik, tidak mudah terbakar, tidak bereaksi dengan zat yang disari, tidak bercampur
dengan air dan mudah didapatkan. Ekstraksi digolongkan menjadi ke dalam macam berdasarkan fase yang
ekstraksi, yaitu ekstraksi cair-cair dan ekstraksi cair-padat Snyder and Kirkldan, 1997. Ekstraksi terdiri dari beberapa metode yakni maserasi, perkolasi dan ekstraksi
sinambung Soxhlet. Maserasi, perkolasi dan soxhelatsi merupakan metode
penyarian dengan alat yang sering digunakan . Metode ekstraksi dingin dapat dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi karena tanpa disertai pemanasan
sedangkan soxhletasi merupakan metode ekstraksi panas karena dalam proses disertai pemanasan Depkes RI, 2000.
Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperature kamar. Maserasi
termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada kesetimbangan. Keuntungan metode ini adalah lebih mudah dan untuk senyawa yang
bersifat termolabil. Kelemahan maserasi adalah jika konsentrasi senyawa aktif pada cari penyari telah jenuh maka senyawa zat aktif di dalam simplisia tidak dapat
terekstraksi seluruhnya sehingga perlu diganti penyari baru Depkes RI, 2000. Pemisah senyawa aktif dalam ekstrak dapat dilakukan dengan partisi. Proses
partisi sangat tergantung pada daya larut solut dalam dalam pelarut solven yang tidak saling campur dan berbeda polaritasnya. Prinsip partisi adalah melarutkan
senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar larut dalam senyawa non polar. Senyawa aktif tersebut terpisah berdasarkan kelarutannya dalam dua macam
pelarut yang tidak saling campur dan berbeda polaritasnya berdasarkan prinsip like dissolves like
Snyder and Kirkldan, 1997.
G.Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan penilaian terhadap metode tertentu secara laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan
yang ditentukan dalam penggunaannya. Parameter analisis yang digunakan untuk
menvalidasi metode adalah linieritas, ketepatan accurary dan ketelitian precision Harmita, 2004. Tujuan akhir validasi metode analisis adalah untuk memastikan
bahwa pengukuran dalam analisis yang akan dilakukan dapat memberikan hasil yang mendekati accepted true value untuk tiap penetapan analisis dalam sampel.
Kesalahan dapat didefinisikan sebagai perbedaan antara hasil pengukuran nilai perhitungan dengan nilai sebenarnya. Namun pada dasarnya nilai kuantitas dari suatu
pengukuran tidak dapat diketahui secara pasti Rohman, 2007. Validasi metode analisis digunakan untuk membuktikan bahwa metode
analisis memenuhi spesifikasi kualitas data yang ditentukan dan kesalahan error berada dalam batas yang diijinkan. Pada dasarnya kesalahan dalam analisis terbagi
menjadi tiga, yaitu: 1. Kesalahan nyata gross error
Kesalahan nyata merupakan yang jelas dilakukan dan melibatkan kesalahan yang besar. Kesalahan ini tidak dapat ditolerir sehinnga untuk mengatasinya adalah
dengan mengulang kembali percobaan yang dilakukan. Contoh kesalahan nyata adalah sampel tumpah, larutan pereaksi salah dan salah mengambil sampel Rohman,
2007. 2. Kesalahan sistemik Systematic error
Kesalahan sistematik merupakan kesalahan dengan nilai definitif nilai tertentu, di mana hasil analisis yang mengandung kesalahan dapat mengarah ke arah
yang lebih kecil atau ke arah yang lebih besar dari rata-rata Rohman, 2007. Kesalahan sistemik berhubungan dengan ketepatan yang berasal dari sumber yang
diprediksi. Kesalahan sistematik tidak tergantung pada jumlah pengukuran sehingga dapat dikurangi dengan memperbanyak jumlah pengukuran. Kesalahan sistemik
dinyatakan dengan nilai fungsi perolehan kembali recovery function. Kesalahan ini masih diperbolehkan apabila memenuhi syarat yang ditentukan.
3. Kesalahan acak random error Kesalahan acak disebut juga kesalahan yang tidak tergantung intermediate
error yang tidak dapat diprediksi sehingga nilainya fluktuatif Rohman, 2007.
Kesalahan ini kesalahan berhubungan dengan ketelitian yang berasal dari sumber yang tidak dapat diprediksi. Kesalahan acak berhubungan dengan nilai presisi dari
suatu metode di mana dalam parameter koefisien variasi CV atau simpangan baku relatif RSD. Kesalahan ini masih diterima apabila nilai koefisien variasi atau
simpangan baku masih di bawah batas yang diijinkan. Parameter untuk validasi sebagai berikut :
1. Linieritas
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk membuktikan bahwa metode korelasi yang baik dan proporsional terhadap respon instrument dan
konsentrasi dalam sampel Harmita, 2004, lininearitas dapat ditentukan dengan melakukan pengukuran pada beberapa analit. Nilai slope atau kemiringan b,
intersep a dan kofisien korelasi dengan nilai mendekati 1 menunjukkan korelasi yang baik antara konsentrasi analit dan respon Harmita, 2004. Menurut Kingston
2004 suatu analisis dikatakan memiliki korelasi yang baik jika baik jika koefisien korelasi 0,99.
2. Presisi
Presisi adalah kedekatan hasil uji dengan memperoleh pengukuran dari berbagai contoh dalam kondisi normal. Presisi menunjukkan ukuran derajat
kesesuaian antara hasil uji yang diukur melalui hasil penyebaran hasil uji rata-rata yang ditetapkan secara berulang pada sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. Presisi dapat didapat tiga tingkatan, yaitu keterulangan repeatability,
intermediate precision , dan reproducibility Ermer and Miller, 2005.
Pada umumnya nilai presisi dihitung menggunakan standar deviasi SD untuk menghasilkan Relative Standard Deviasion RSD atau Coeficient Variation
CV. Presisi yang baik dinyatakan dengan semakin kecil persen RSD maka nilai
presisi yang didapatkan semakin bagus SD =
−
2
�−1
x = nilai dari masing-masing pengukuran x mean = rata-rata mean dari pengukuran
N = frekuensi penetapan N-1 = derajat kebebasan
RSD =
SD x mean
x100 RSD = Standar deviasi relatif
SD = Standar deviasi X mean = Rata-rata Gandjar dan Rohman, 2007.
Tabel I. Nilai presisi yang dapat diterima menurut Kingston 2004
Kadar zat aktif Nilai RSD yang masih dapat diterima
10 2
1-10 5
0, 1-1 10
0, 1 20
3. Spesifisitas
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain
yang mungkin ada dalam sampel atau sering juga diartikan spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adaya
komponen-komponen lain .
Dalam artian metode preparasi sampel tidak boleh hanya membawa jumlah yang terukur dari sampel tetapi komponen yang bersama-sama
dengan analit tidak boleh mengganggu dalam analisis Ohanesian et al, 2002.
H. Landasan Teori
Antioksidan merupakan sebutan untuk zat yang berfungsi melindungi tubuh dari serangan radikal bebas. Yang termasuk ke dalam golongan zat ini antara lain
vitamin, polifenol, karotin dan mineral. Secara alami, zat ini sangat besar peranannya pada manusia untuk mencegah terjadinya penyakit. Antioksidan melakukan semua ini
itu dengan menekan kerusakan sel yang terjadi akibat proses oksidasi radikal bebas.
Pada tanaman trembesi mengandung flavonoid dan senyawa fenolik yang kemampuan menangkap radikal bebas. Tanaman trembesi telah digunakan sebagai
pengobatan tradisional di Venezuala dan biji trembesi biasa digunakan sebagai tempe untuk mengganti kedelai.
Kadar fenolik pada sampel ditentukan oleh kemampuan sampel mereduksi reagen Folin-Ciocalteu yang mengandung senyawa asam fosfomolibdat-fosfotungstat
berwarna kuning yang akan membentuk senyawa kompleks berwarna biru. Warna ini dapat diukur intesitasnya dengan spektrofotometri visible.
I. Hipotesis
Fraksi air ekstrak etanol biji trembesi memiliki kandungan senyawa fenolik yang dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat pergram fraksi air ekstrak etanol
biji trembesi dan aktivitas antioksidan yang dinyatakan dalam IC
50.
22
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan termasuk eksperimental dengan rancangan acak sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi.
2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanolik biji
trembesi. 3.
Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur tanaman, dan cara panen.
4. Variabel pengacau tidak terkendali berupa cahaya matahari, iklim dan cuaca.
C. Definisi Operasional
1. Ekstrak etanolik biji trembesi adalah sari hasil proses maserasi biji trembesi
dengan penyari etanol 70 . 2.
Fraksi air adalah hasil fraksi ekstrak etanolik biji trembesi dengan menggunakan air yang telah difraksinasi menggunakan washbensin dan etil asetat.
3. Persen inhibition concentration IC adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi air ekstrak etanolik biji trembesi untuk menangkap radikal DPPH.
