cepat terurai dalam larutan alkali, sehingga perlu untuk menggunakan reagen secara berlebih untuk mendapatkan reaksi yang lengkap. Tetapi penggunaan
reagen berlebih dapat menimbulkan endapan dan kekeruhan yang tinggi, sehingga membuat analisis spektrofotometri tidak bisa dilakukan. Untuk mengatasi masalah
ini, didalam reagen Folin Ciocalteu terdapat garam lithium, yang dapat mencegah kekeruhan. Reaksi ini pada umumnya memberikan data yang akurat dan spesifik
pada beberapa kelompok senyawa fenolik Blainski et al., 2013.
G. Metode DPPH
Metode uji ini menggunakan radikal bebas DPPH 2,2-difenil-1- pikrilhidrazil. Radikal bebas DPPH dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat
mendonorkan atom hidrogen. Tujuan metode ini adalah untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50 efek aktivitas antioksidan
IC
50
yaitu dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode DPPH tersebut Dehpour et al., 2009.
Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan. DPPH sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan
sebagai free radical scavengers atau donor hidrogen, mengevaluasi aktivitas antioksidannya dan mengkuatifikasi jumlah kompleks radikal antioksidan yang
terbentuk Prakash et al., 2001.
Gambar 3. Struktur DPPH Molyneux, 2004
Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, sensitif, dan reprodusibel untuk pengujian aktivitas antioksidan Savatovic et al., 2012. DPPH
memberikan serapan kuat pada 517 nm dikarenakan adanya elektron yang tidak berpasangan. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan
penangkap radikal bebas, maka absorbansinya akan menurun. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi
kuning. Perubahan absorbansi akibat dari reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas
Dehpour et al., 2009.
Gambar 4. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan Prakash et al., 2001
Warna DPPH yang berubah dari warna ungu menjadi kuning dikarenakan adanya penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH
berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh antioksidan setara dengan jumlah elektron yang tertangkap Prakash et al., 2001.
H. Spektofotometri Visibel
Prinsip spektrofotometri UVVisibel yaitu radiasi pada rentang panjang gelombang 200
–700 nm dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron pada ikatan dalam molekul menjadi tereksitasi sehingga berada pada keadaan energi
yang lebih tinggi dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan tersebut Watson, 2010. Absorpsi cahaya ultraviolet atau cahaya tampak
mengakibatkan adanya transisi elektronik, yaitu perpindahan elektron dari orbital dasar yang energinya rendah menuju keadaan tereksitasi yang energinya lebih
tinggi Fessenden dan Fessenden, 1982. Hal - hal yang perlu diperhatikan dalam analisis spektrofotometri antara
lain waktu operasional dan panjang gelombang maksimum. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan
absorbansi larutan. Tujuan dari waktu operasional untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Pada awal terjadi reaksi absorbansi akan terus meningkat
hingga pada waktu tertentu absorbansi yang dihasilkan stabil. Terdapat kemungkinan senyawa mengalami kerusakan atau terurai sehingga menyebabkan
intensitas warna dan absorbansinya menurun seiring bertambahnya waktu. Oleh karena hal tersebut perlu dilakukan pengukuran pada saat waktu operasional yang
tepat Gandjar dan Rohman, 2007. Panjang gelombang yang digunakan dalam pengukuran adalah panjang
gelombang yang memiliki absorbansi maksimal. Pada panjang gelombang maksimal kepekaan yang dihasilkan tinggi. Oleh karena itu perubahan absorbansi
untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar Gandjar dan Rohman, 2007.
I. Landasan Teori
Radikal bebas merupakan suatu atom atau molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga relatif tidak stabil.
Antioksidan seperti asam fenolik, polifenol, dan flavonoid merupakan senyawa pemberi elektron yang dapat memerangi aktivitas oksidan dalam tubuh yang dapat
mencegah timbulnya penyakit degeneratif. Buah buni merupakan sumber antioksidan yang memiliki kandungan
senyawa fenolik, flavonoid dan antosianin yang tinggi. Ekstrak metanol buah buni mengandung antosianin prosianidin B1, prosianidin B2, flavonoid katekin,
epikatekin, rutin, mirisetin, resveratrol, luteolin, kuersetin, naringenin, dan kaempferol dan asam fenolik asam galat, asam kafeat, asam elagat, dan asam
ferulat yang tinggi. Maserasi dipilih karena metodenya tidak menggunakan panas dan tidak
merusak kandungan senyawa dalam buah buni. Etanol 96 dipilih sebagai pelarut karena bersifat polar sehingga diharapkan senyawa
– senyawa flavonoid dan fenolik yang bersifat polar dapat tersari ke dalam etanol. Etanol dapat menyari
berbagai macam senyawa fenolik seperti polifenol, flavonoid, antosianindan tanin. Metode yang sering digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan
adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan rutin sebagai kontrol positif karena rutin merupakan salah satu senyawa flavonoid dalam tanaman yang telah
diketahu mempunyai aktivitas antioksidan. Tujuan metode ini adalah untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50 efek aktivitas
antioksidan IC
50
, yaitu dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode DPPH tersebut.
Aktivitas antioksidan juga berhubungan dengan kadar fenolik totalnya, kadar fenolik total dapat ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode
Folin-Ciocalteu didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Kandungan fenolik total dinyatakan dengan ekuivalen
asam galat sebagai pembanding karena asam galat merupakan salah satu senyawa asam fenolik yang banyak terdapat dalam tanamanyang mempunyai aktivitas
antioksidan.
J. Hipotesis
