Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda, yaitu konsentrasi tinggi, tengah, dan rendah. Setiap
konsentrasi akan memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum, sehingga ketiga konsentrasi larutan asam galat, yaitu yaitu
50 μgmL, 100 μgmL, dan 150 μgmL.
Penggunaan tiga
konsentrasi tersebut
diharapkan akan
mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada masing – masing
konsentrasinya. Scanning panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 600 nm
– 800 nm, dimana menurut Blainskiet al. 2013 panjang gelombang serapan maksimum untuk pereaksi Folin-Ciocalteu yang
direaksikan dengan senyawa fenolik adalah 760 nm.
Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum asam galat yang direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu
Konsentrasi larutan asam galat
maksimum hasil scanning nm
maksimum yang digunakan
50 750
745 100
746 150 µgmL
740 Dari hasil scanning pada tiga seri konsentrasi asam galat pada tabel,
didapatkan rata – rata panjang gelombang maksimum sebesar 745 nm. Panjang
gelombang tersebut yang digunakan untuk pengukuran absorbansi kurva baku asam galat dan pengujian kandungan fenolik total sampel.
G. Penetapan Kandungan Fenolik Total
Potensi senyawa fenolik sebagai antioksidan disebabkan oleh keberadaan gugus hidroksil dalam senyawa fenol. Gugus hidroksil berfungsi
sebagai penyumbang atom hidrogen ketika bereaksi dengan senyawa radikal melalui mekanisme transfer elektron sehingga proses oksidasi dapat terhambat.
Menurut Haci et al., 2009, prinsip reaksi pada metode Folin Ciocalteu adalah ion fenolat akan mereduksi asam fosfomolibdat-fosfotungstat
dalam reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa selama proses oksidasi fenol menjadi senyawa kompleks molybdenum-tungsten berwarna biru.Ion fenolat
dibentuk melalui disosiasi proton dalam suasana basa yang didapatkan dari suatu senyawa alkali. Senyawa alkali yang digunakan adalah natrium karbonat.
Semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka ion fenolat yang terbentuk pun semakin banyak, sehingga semakin banyak ion fenolat yang
mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat yang menyebabkan warna biru yang terbentuk semakin pekat, hal ini menyebabkan absorbansi yang terukur pun akan
semakin besar. Kandungan fenolik total dalam ekstrak etanol buah buni yang
diperoleh ditetapkan sebagai massa ekivalen asam galat. Asam galat digunakan sebagai sebagai senyawa pembanding karena asam galat merupakan asam
heteropoli yang mempunyai 3 gugus hidroksi fenolat. Gugus hidroksi fenolat tersebut yang akan dioksidasi oleh reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa.
Reagen Folin-Ciocalteu akan mengoksidasi asam galat pada gugus hidroksi fenolatnya membentuk kompleks molybdenum-tungsten yang memiliki warna biru
Alfian dan Susanti, 2012. Pada saat reaksi berlangsung terjadi reduksi ion molybdenum Mo
6+
menjadi Mo
5+
yang menyebabkan perubahan warna larutan kuning menjadi biru Prior, 2005.
Gambar 13. Reaksi asam galat dengan senyawa molybdenum dari reagen Folin-Ciocalteu Nunes, et al., 2012
Pembuatan kurva baku ini dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Kurva baku ini menghasilkan suatu persamaan regresi linier yang digunakan
dalam menentukan jumlah kandungan fenolik total dalam sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total.
Menurut Gandjar dan Rohman 2007 persamaan regresi dengan linieritas terbaik yaitu jika nilai r mendekati 1. Persamaan regresi linear terbaik akan digunakan
untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel III menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat.
Tabel III. Hasil pengukuran absorbansi asam galat yang telah direaksikan dengan reagen Folin-Ciocalteu pada
745 nm
Replikasi Konsentrasi
µgmL Absorbansi
Persamaan regresi linear
1 50
0,268 y = 0,0050x + 0,0002
r = 0,9961 75
0.344 100
0,498 125
0,622 150
0,749
2 50
0,239 y = 0,0047x + 0,0040
r = 0,9989 75
0,369 100
0,475 125
0,585 150
0,724
3 50
0,232 y = 0,0048x
– 0,0032 r = 0,9995
75 0,360
100 0,482
125 0,587
150 0,717
Gambar 14. Kuva baku asam galat dalam penetapan fenolik total Replikasi 3
Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,0048x - 0,0032
dengan linieritas sebesar 0,9995. Nilai linieritas menunjukkan korelasi antara
y = 0.0048x - 0.0032 r = 0.9995
0,1 0,2
0,3 0,4
0,5 0,6
0,7 0,8
50 100
150 200
Abs o
rba ns
i
Konsentrasi gmL
konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linieritas nilai R sama dengan 1 atau mendekati 1 maka korelasi juga semakin baik.
Tabel IV. Hasil penentuan jumlah fenolik total ekstrak etanol buah buni
Absorbansi Kandungan
fenolik total mg GAEg
Rata – rata
± SD mg GAEg
CV Replikasi 1
0,681 0,2849
0,2794 ± 0,0048
1,7180 Replikasi 2
0,661 0,2769
Replikasi 3 0,660
0,2764 Tabel IV menunjukkan hasil pengukuran sampel uji untuk penentuan
kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil
perhitungan menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah buni memiliki nilai kandungan fenolik total rata
– rata sebesar 0,2794 ± 0,0048 mg ekivalen asam
galat gram ekstrak etanol buah buni.
Penelitian yang dilakukan oleh Butkhup dan Samappito 2011, menunjukkan bahwa kadar fenolik total ekstrak metanol buah buni yang diperoleh
adalah sebesar 8,66 ± 1,14 mg ekivalen asam galatgram, sedangkan hasil kadar senyawa fenolik pada penelitian ini tergolong rendah. Hal ini karena jenis pelarut
yang digunakan dan cara ekstraksi yang berbeda. Jenis pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etanol 96 ,
etanol mempunyai sifat polar tetapi tidak lebih polar dibandingkan dengan metanol. Menurut Boeing et al. 2014 solvasi etanol dalam melarutkan senyawa
fenolik yang berefek antioksidan lebih rendah daripada metanol karena etanol mempunyai rantai C yang lebih panjang daripada metanol, sehingga senyawa
senyawa fenolik yang bersifat polar akan lebih terlarut pada metanol. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Menurut Sari et al. 2013, lama waktu ekstraksi dapat mempengaruhi kandungan senyawa fenolik yang ada dalam suatu tanaman. Waktu perendaman
buah buni yang terlalu lama dalam penelitian ini, dapat meningkatkan peluang untuk terjadinya oksidasi senyawa fenolik sehingga kandungan total fenolik yang
terekstrak turun, dan kadar fenolik yang diperoleh kecil. Hal ini juga dibuktikan pada penelitian yang dilakukan oleh Cooper-Driver dan Balick 1978 bahwa
bahan yang direndam dengan etanol selama 1 bulan masih mengandung senyawa fenolik walaupun kadarnya rendah.
Menurut Blainski et al. 2013 reagen Folin-Ciocalteu mempunyai kelemahan, yaitu sangat cepat terurai dalam larutan alkali sehingga dapat
menimbulkan endapan dan kekeruhan yang dapat menganggu pengukuran absorbansi. Pengatasan kelemahan tersebut dalam penelitian ini adalah dengan
mengambil supernatan bagian atas untuk diukur dalam spektrofotometer. Supernatan tersebut dianggap tidak mengandung endapan sehingga tidak
mengganggu dalam pengukuran.
H. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan
