h. Uji antrakuinon
Uji Brontrager dan uji Brontrager termodifikasi bisa mendeteksi adanya antrakuinon, antrakuinon akan memberikan karakteristik warna merah, violet,
hijau atau ungu dengan basa Marliana et al., 2005. Uji Brontrager bisa mendeteksi senyawa antrakuinon, namun uji ini akan menunjukkan negatif untuk
glikosida antrakuinon yang sangat stabil atau turunan tereduksi dari tipe antranol. Oleh karena itu uji Brontrager dimodifikasi dengan melakukan uji Brontrager
sebelumnya untuk menghidrolisis dan mengoksidasi senyawa antrakuinon. Tidak terjadinya perubahan warna pada uji Brontrager menunjukkan tidak adanya
antrakuinon pada ekstrak antrakuinon karena antrakuinon yang terdapat dalam ekstrak kemungkinan sangat stabil atau turunan tereduksi dari tipe antranol
sehingga menyebabkan hasil negatif.
F. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total
1. Penentuan operating time
Penentuan operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu dimana reaksi antara sampel dan pereaksi berada pada kondisi optimum. Reaksi yang
optimum ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang relatif stabil. Pada awal reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan terus meningkat hingga pada waktu
tertentu akan diperoleh absorbansi yang stabil. Tetapi, semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut akan mengalami
kerusakan sehingga
menyebabkan intensitas
warnanya menurun
dan absorbansinya juga menurun Gandjar dan Rohman, 2007.
Penentuan OT dilakukan menggunakan asam galat sebagai senyawa pembanding. Asam galat digunakan sebagai standar karena asam galat adalah
salah satu senyawa fenolik dan memiliki aktivitas antioksidan Fiuza et al., 2004. Penentuan OT ini dilakukan dengan mereaksikan senyawa baku asam galat dan
reagen Folin-Ciocalteu. Hasil reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu akan membentuk kompleks berwarna biru sehingga warna larutan
menjadi biru yang selanjutnya diukur dengan spektrofotometer visibel. Reaksi dianggap optimal apabila absorbansi dari tiap selang waktu yang diukur telah
stabil. Absorbansi yang stabil terlihat dari makin kecilnya selisih absorbansi antar selang waktu. Pengukuran OT dilakukan selama satu jam dengan waktu
pengamatan setiap 5 menit sekali. Penentuan OT dilakukan pada 3 konsentrasi yang berbeda. Setiap
konsentrasi memberikan nilai absorbansi yang berbeda pada panjang gelombang maksimum teoritis, sehingga ketiga konsentrasi tersebut akan mempresentasikan
OT pada masing – masing konsentrasinya. Konsentrasi yang digunakan yaitu 50
μgmL, 100 μgmL, dan 150 μgmL. Operating time dilakukan menggunakan panjang gelombang teoritis.
Panjang gelombang teoritis yang digunakan untuk menentukan operating time dari reaksi penentuan fenolik total adalah 760 nm Blainski et al., 2013.
Gambar 12. Grafik penentuan operating time asam galat
Dari grafik Gambar 12 terlihat pada menit ke 30 nilai absorbansi yang didapat telah stabil, berarti reaksi sudah berjalan sempurna. Sehingga dapat
disimpulkan OT untuk pengukuran asam galat adalah 30 menit.
2. Penentuan panjang gelombang maksimum
