Jenis dan Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Analisis Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Klasifikasi variabel

a. Variabel utama 1 Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanol buah buni 2 Variabel tergantung : aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni. b. Variabel pengacau 1 Variabel pengacau terkendali : waktu pemanenan, umur tanaman yang dipanen, dan metode ekstraksi. 2 Variabel pengacau tak terkendali : kondisi cuaca dan lingkungan pada tempat tumbuh tanaman.

2. Definisi operasional

a. Ekstrak etanol buah buni adalah ekstrak kental yang diperoleh dari maserasi buah buni yang masih segar selama 24 jam dengan etanol 96 dan diremaserasi sebanyak dua kali selama 24 jam dengan pelarut yang sama lalu diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh pengurangan berat ekstrak yang tetap sebesar 0,01. b. Metode DPPH adalah salah satu metode pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. Prinsip metode ini adalah penangkapan radikal bebas yang menyebabkan elektron bebas menjadi berpasangan dan mengakibatkan pemudaran warna ungu. c. Persen inhibitory concentration IC adalah persen yang menyatakan kemampuan ekstrak etanol buah buni dalam menghambat radikal bebas dalam hal ini DPPH. d. Inhibitory concentration 50 IC 50 adalah konsentrasi ekstrak etanol buah buni yang dapat menghambat 50 radikal bebas DPPH.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah buah buni yang diambil dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Aquadest dan etanol 96 diperoleh dari CV. General Labora. Natrium karbonat p.a diperoleh dari laboratorium Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Bahan kimia kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA berupa rutin, asam galat, reagen Folin-Ciocalteu, DPPH 2,2- diphenyl-1-picrylhdrazyl. Reagen Mayer LP, Dragendroff LP, serbuk magnesium P, gelatin 1, dan bahan kimia pro analitik E. Merck berupa metanol, asam asetat glasial, asam klorida 37, kloroform, natrium hidroksida, besi III klorida, KOH, hidrogen peroksida, asam sulfat, benzena, ammonia yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : spektrofotometer UV- Vis Shimadzu, vacuum rotary evaporator buchi rotavapor, maseratororbital shaker, corong Buchner, pompa vaccum, waterbath Labo-tech, Haraeus, neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160p, oven, vortex Junke Kunkel, micropipet 50 – 200 μl, micropipet 200 – 1000 μl, dan alat – alat gelas Pyrex-Germany dan Iwaki. E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Buah buni yang diteliti dideterminasi menurut pustaka acuan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Proses determinasi dilakukan dengan menggunakan bagian tanaman buni seperti daun, buah, dan bunga.

2. Pengambilan bahan buah buni

Buah buni diperoleh dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Cara pemanenan buah buni yang digunakan pada penelitian ini yaitu, diambil buah yang berwarna ungu kehitaman berbentuk bulat telur dengan permukaan kulit licin halus dan buah tidak jatuh ke tanah. Pemanenan buah buni dilakukan bulan Februari 2015 pada pagi hari pukul 09.00 WIB.

3. Pembuatan ekstrak

Sebanyak 1000 g buah buni segar dicuci beberapa kali menggunakan air mengalir dan diangin-anginkan, kemudian direndam dengan etanol 96 setinggi kurang lebih dua sentimeter dari tinggi buah buni dan didiamkan dalam tempat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI gelap selama 5 bulan, kemudian dilakukan maserasi selama 24 jam dengan etanol 96 dan diremaserasi sebanyak dua kali selama 24 jam dengan pelarut yang sama. Hasil maserasi dan remaserasi disaring kemudian filtrat yang diperoleh dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 60 C sehingga diperoleh ekstrak kental etanol buah buni. Hasil penguapan dari rotary evaporator diuapkan kembali di waterbath untuk menghilangkan seluruh pelarut yang masih terdapat di dalam ekstrak. Ekstrak kental ditimbang dan dihitung rendemen ekstrak kemudian disimpan dalam desikator.

4. Uji pendahuluan

a. Uji fenolik Sebanyak 0,5 mL larutan uji dengan konsentrasi 11 mgmL dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µgmL masing – masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades dengan perbandingan 1:10 vv dalam tabung reaksi. Campuran didiamkan selama 10 menit, lalu ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna larutan diamati secara visual dengan mata. b. Uji aktivitas antioksidan Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing – masing tiga tabung reaksi, kemudian ke dalam masing – masing tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL metanol p.a., larutan pembanding rutin 25 µgmL, dan larutan uji 11 mgmL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a., lalu divortex selama 30 detik. Selama 30 menit, warna larutan tersebut diamati secara visual dengan mata.

5. Skrining fitokimia ekstrak etanol 96 buah buni

a. Pembuatan larutan uji Pembuatan larutan uji untuk uji fitokimia dilakukan dengan cara melarutkan sebanyak 500 mg ekstrak etanol 96 buah buni dilarutkan dengan 50 mL etanol 96, kemudian didapat larutan uji yang digunakan untuk skrining fitokimia. b. Uji saponin Sebanyak 0,05 g sampel dilarutkan dalam 10 mL akuades, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Dikocok vertikal selama 30 detik kemudian dibiarkan selama 30 detik, diamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa yang tetap maka identifikasi menunjukkan adanya saponin Marliana et al., 2005. c. Uji flavonoid Sebanyak 3 mL larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan serbuk Mg dan 5 tetes HCl pekat. Jika menghasilkan warna kuning, oranye, dan merah menandakan adanya flavonoid Nafisah et al., 2014. d. Uji triterpenoid dan steroid Larutan uji sebanyak 2 mL diuapkan dalam cawan porselen. Residu dilarutkan dengan 0,5 mL kloroform, setelah itu ditambahkan dengan asam asetat anhidrat sebanyak 0,5 mL. Selanjutnya ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan, sedangkan adanya steroid ditandai dengan terbentuknya cincin biru kehijauan Hayati dan Halimah, 2010. e. Uji minyak atsiri Larutan uji dipipet sebanyak 1 mL kemudian diuapkan diatas cawan porselen hingga diperoleh residu. Hasil positif minyak atsiri ditandai dengan bau khas yang dihasilkan oleh residu tersebut Padmasari et al., 2013. f. Uji alkaloid Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan diatas cawan porselen. Residu yang terbentuk dilarutkan dengan 5 mL HCl 2 N. Larutan yang dihasilkan dibagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama berfungsi sebagai blanko yang ditambahkan dengan HCl, tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi Dragendorff dan tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi Mayer. Hasil positif adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan endapan kuning pada tabung ketiga Puspitasari et al., 2013. g. Uji tanin dan polifenol Sebanyak 3 mL larutan ekstrak uji dibagi ke dalam 3 bagian yaitu tabung A, tabung B, dan tabung C. Tabung A digunakan sebagai blanko, tabung B direaksikan dengan larutan besi III klorida 10, warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tannin dan polifenol, sedangkan pada tabung C hanya ditambahkan gelatin 1. Apabila terbentuk endapan pada tabung C maka larutan ekstrak positif mengandung tannin Marliana et al., 2005. h. Uji antosianin Sebanyak 10 mL larutan uji ditambahkan HCl 2 M kemudian dipanaskan 100 C selama 5 menit. Hasil positif bila timbul warna merah. Juga ditambahkan NaOH 2M tetes demi tetes sambil diamati perubahan warna yang terjadi. Hasil positif bila timbul warna hijau biru yang memudar perlahan – lahan Putri dan Gunawan, 2015. i. Uji antrakuinon Uji Brontrager dilakukan dengan cara mengambil 0,05 gekstrak dan dilarutkan dengan 10 mL akuades kemudian disaring, filtrat diekstrak dengan 5 mL benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A digunakan sebagai blanko dan filtrat B ditambahkan 5 mL amonia kemudian dikocok, bila terdapat warna merah berarti hasil positif Marliana et al., 2005. Uji Brontrager termodifikasi dilakukan dengan melarutkan 0,05 g sampel dengan 10 mL 0,5 N KOH dan 1 mL larutan hidrogen peroksida. Kemudian dipanaskan pada waterbath selama 10 menit, didinginkan dan disaring. Pada filtratnya ditambahkan asam asetat bertetes – tetes sampai pada kertas lakmus menunjukkan asam. Selanjutnya diekstrak dengan 5 mL benzena. Hasil ekstrak dibagi menjadi 2 bagian, A dan B. Larutan A digunakan sebagai blanko, sedangkan larutan B dibuat basa dengan 2 – 5 mL larutan amonia. Perubahan warna pada lapisan basa diamati. Warna merah atau merah muda menunjukkan adanya antrakuinon PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

6. Penentuan kandungan fenolat total

a. Pembuatan larutan asam galat Asam galat ditimbang sebanyak 25 mg, kemudian dimasukkan ke dalam gelas Beker dan dilarutkan dengan aquades : metanol p.a 1:1. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, tambahkan akuades : metanol p.a 1:1 sampai batas tanda. Larutan tersebut diambil sebanyak 0,5; 0,75 ; 1 ; 1,25 dan 1,5 mL, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan tambahkan aquades : metanol p.a 1:1 sampai batas tanda, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 g mL. b. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total Ekstrak etanol buah buni ditimbang sebanyak 250 mg, larutkan menggunakan metanol p.a dalam gelas beker. Kemudian masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda. Larutan intermediet dibuat dengan mengambil 3,6 mL dari larutan stok, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda. Sejumlah 2,5 mL larutan intermediet diambil, masukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda. Konsentrasi larutan uji sebesar 4500,0 g mL. c. Penentuan operating time Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 150 gmL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2,0 mL pada masing – masing larutan. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Baca absorbansi larutan setiap 5 menit dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 60 menit. d. Penentuan panjang gelombang maksimum Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 100; dan 1 50 gmL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2 mL pada masing – masing larutan. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time yang telah didapat, kemudian dilakukan scanning panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang 600-800 nm. e. Pembuatan kurva baku asam galat Larutan asam galat dengan konsentrasi 50; 75; 100; 125; dan 150 gmL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2 mL.Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M, diamkan selama operating time yang telah didapat. Baca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali. f. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Larutan uji dengan konsentrasi 4500,0 gmL diambil sebanyak 0,5 mL. Reagen Folin-Ciocalteu ditambahkan sebanyak 2mL. Selanjutnya, ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M, diamkan selama operating time yang telah didapat. Baca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7. Penentuan aktivitas antioksidan

a. Pembuatan larutan DPPH Sejumlah DPPH ditimbang sebanyak 5 mg dan dilarutkan dengan metanol p.a. di dalam labu ukur 50 mL sehingga diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100 . Diambil sebanyak 5 mL larutan stok DPPH kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 25,0 mL. Larutan ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru. b. Pembuatan larutan stok rutin Sejumlah 5 mg rutin dilarutkan dalam metanol p.a sampai 50,0 mL. c. Pembuatan larutan standar rutin Kemudian diambil sebanyak 3,0 ; 4,0 ; 5,0; 6,0; dan 7,0 mL larutan stok, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 30; 40; 50; 60; dan 70 µgmL. d. Pembuatan larutan uji Sejumlah 250,0 mg ekstrak etanol buah buni ditimbang kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 2,0 mL untuk ditambahkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL, menjadi larutan intermediet. Kemudian diambil 0,6; 1,0; 1,4; 1,8; dan 2,2 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 600; 1000; 1400; 1800; 2200 µgmL. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI e. Pembuatan larutan kontrol Larutan yang digunakan adalah 0,2 mL metanol p.a dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 3,8 mL DPPH, divortex selama 30 detik. Didiamkan selama 30 menit Reaction Time. f. Penentuan operating time OT Digunakan 3 konsentrasi rutin 5, 15, 25 µgmL. Sebanyak 3,8 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup kemudian ditambah dengan 0,2 mL larutan standar rutin. Campuran larutan tadi kemudian divortex selama 30 detik. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang maksimal 517 nm setiap 5 menit selama 60 menit sampai diketahui terjadi penurunan absorbansi secara nyata. g. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 20, 30, 40 µgmL ditentukan spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 400 nm hingga 700 nm. Dan ditentukan panjang gelombang optimumnya. h. Penentuan aktivitas antioksidan Dari masing – masing larutan uji dipipet 0,2 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 3,8 mL DPPH 20 µgmL, divortex selama 30 detik, kemudian didiamkan selama 30 menit Operating Time dan diukur serapannya pada panjang gelombang 516 nm. Dilakukan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pengujian yang sama untuk pembanding rutin. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. i. Estimasi aktivitas antioksidan Hasil dari prosedur, dihitung nilai IC dan IC 50 untuk rutin dan ekstrak etanol buah buni.

F. Analisis Data

Kandungan fenolik total ekstrak etanol buah buni dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat GAE per g ekstrak etanol buah buni. Nilai absorbansi larutan uji yang telah didapatkan dimasukkan ke dalam persamaan kurva persamaan regresi linear asam galat, sehingga diperoleh nilai ekivalensi larutanuji terhadap asam galat. Kandungan fenolik total diperoleh berdasarkan rumus : Konsentrasi ekstrak etanol buah buni x Aktivitas penghambatan radikal bebas DPPH IC dihitung dengan menggunakan rumus : IC= x 100 Setelah didapatkan presentase inhibisi dari masing – masing konsentrasi, kemudian ditentukan persamaan y = a + bx dengan perhitungan secara regresi linear dimana x adalah konsentrasi µgmL dan y adalah presentase inhibisi . Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition Concentration 50 IC 50 yaitu konsentrasi sampel yang dapat menghambat radikal. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang diidentifikasi menurut acuan Flora untuk Sekolah di Indonesia 1992. Determinasi tumbuhan ini bertujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan benar Antidesma bunius L. Spreng. Bagian tanaman yang digunakan untuk determinasi adalah daun, batang, bunga dan buah. Determinasi dilakukan sampai kategori spesies, hasil determinasi menunjukkan bahwa buah buni yang digunakan dalam penelitian ini memiliki nama ilmiah Antidesma bunius L. Spreng Lampiran 1 dengan warna kulit buah ketika masih muda hijau, ketika hampir matang berwarna merah, dan ketika matang berwarna ungu kehitaman dengan permukaan kulit yang licin dan halus.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah buni yang digunakan pada penelitian ini berasal dari taman Kampus III Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta tepatnya di depan laboratorium Farmasetika Dasar. Bahan berupa buah buni hanya berasal dari satu pohon di satu tempat, hal tersebut bertujuan agar tidak terjadi variasi kandungan senyawa pada tanaman yang dapat disebabkan oleh adanya perbedaan kondisi tanah, lingkungan, dan unsur hara dari tempat tanaman berasal Rahardjo et al., 2006.