Pembuatan Media Sterilisasi Kotiledon

3.3. Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL non-faktorial dengan variasi konsentrasi kinetin yaitu: K : 0 ppm K 1 : 1 ppm K 2 : 2 ppm K 3 : 3 ppm K 4 : 4 ppm Penelitian ini terdiri dari 5 perlakuan dengan 6 kali ulangan. Pengamatan destruktif sebanyak 4 kali dengan interval waktu 1 minggu. Total botol seluruhnya adalah 120 satuan percobaan. 3.4. Prosedur Kerja 3.4.1. Sterilisasi Alat Alat-alat maupun bahan yang digunakan dalam pembuatan media harus dalam keadaan steril. Alat-alat yang disterilkan adalah cawan petri, aluminium foil, botol kultur, botol berisi akuades, erlenmeyer, pipet volume dicuci dengan deterjen dan dibilas dibawah air mengalir, dikeringkan dalam autoklaf pada temperatur 121 C dan tekanan 15 Psi selama 60 menit.

3.4.2. Pembuatan Media

Tahap pertama dalam pembuatan media adalah pembuatan larutan stok yang terdiri dari stok hara makro, mikro, iron dan vitamin. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS Murashige dan Skoog dengan penambahan Ekstrak Malt dan zat pengatur tumbuh Kinetin dengan konsentrasi 0, 1, 2, 3 dan 4. Pembuatan media sebanyak 1000 ml. Sementara unsur-unsur lain ditimbang sesuai kebutuhan seperti hara makro, sukrosa dan agar. Universitas Sumatera Utara Larutan MS dibuat dengan cara memasukkan hara makro, mikro, iron vitamin, dan sukrosa ke dalam gelas ukur yang ditambahkan akuades hingga 1000 ml kemudian larutan dibagi ke dalam 5 perlakuan yang setiap perlakuannya berisi 200 ml. Kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh kinetin sesuai dengan perlakuan. NAA 0.05 mgl serta Ekstrak Malt ke dalam masing-masing perlakuan. Derajat keasaman pH larutan diukur setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter sebesar 5,8. Agar yang telah ditimbang sebanyak 3,5 g dimasukkan ke dalam masing-masing perlakuan yang berfungsi sebagai pemadat. Lalu media dimasak sampai mendidih. Larutan dituang ke dalam botol kultur steril yang kemudian ditutup dengan aluminium foil, dan diikat dengan karet. Selanjutnya, di autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 Psi selam 30 menit. Lalu botol kultur yang berisi media tersebut diletakkan di ruang kultur untuk menghindari kontaminasi Reinert Bajaj, 1989.

3.4.3 Sterilisasi Kotiledon

Eksplan berupa kotiledon jeruk keprok dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit. Kotiledon jeruk keprok direndam dalam larutan dithane 0,2 g100 ml yang ditambah tween 20 sebanyak 2 tetes dan dishaker selama 2 jam. Selanjutnya kotiledon direndam dengan alkohol 70 selama 1 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Kotiledon disterilkan dengan larutan pemutih dengan bahan aktif NaOH 5 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril dan selanjutnya dengan larutan pemutih 2,5 selama 5 menit. Kotiledon dicuci dengan akuades steril. Selanjutnya kotiledon diletakkan di dalam cawan petri dan dikeringkan dengan kertas saring steril.

3.4.4. Penanaman Kotiledon