Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Metode Penelitian Parameter Pengamatan

BAB 3 BAHAN DAN METODA

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan pada bulan Mei 2010 sampai November 2010 di Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan. Pengamatan Mikroskopik dilakukan di Laboratorium Biologi Dasar, LIDA, Universitas Sumatera Utara, Medan. Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini yaitu jeruk keprok yang berasal dari Pasar Situmba, desa Gunung Tua Baringin, Kecamatan Sipirok, Kabupaten Tapanuli Selatan, Sumatera Utara.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, entkas, botol kultur, aluminium foil, pipet serologi, alat diseksi, gelas piala, gelas ukur, neraca analitik, erlenmeyer, cawan petri, pH meter, bunsen, kertas saring, mikroskop, pipet tetes, gelas objek dan penutup. Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah kotiledon dari jeruk keprok Citrus nobilis Lour. yang telah matang. Selain itu kotiledon juga ditumbuhkan pada media MS. Sterilisasi menggunakan bahan larutan pemutih NaOCL 5,25, fungisida benlate dan tween 20, alkohol 70, akuades, Ekstrak Malt 500 mgl, NAA 0,05 mgl, kinetin, agar-agar, gula, hara makro, hara mikro, iron, vitamin, Myo-inositol dan etanol. Universitas Sumatera Utara

3.3. Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap RAL non-faktorial dengan variasi konsentrasi kinetin yaitu: K : 0 ppm K 1 : 1 ppm K 2 : 2 ppm K 3 : 3 ppm K 4 : 4 ppm Penelitian ini terdiri dari 5 perlakuan dengan 6 kali ulangan. Pengamatan destruktif sebanyak 4 kali dengan interval waktu 1 minggu. Total botol seluruhnya adalah 120 satuan percobaan. 3.4. Prosedur Kerja 3.4.1. Sterilisasi Alat Alat-alat maupun bahan yang digunakan dalam pembuatan media harus dalam keadaan steril. Alat-alat yang disterilkan adalah cawan petri, aluminium foil, botol kultur, botol berisi akuades, erlenmeyer, pipet volume dicuci dengan deterjen dan dibilas dibawah air mengalir, dikeringkan dalam autoklaf pada temperatur 121 C dan tekanan 15 Psi selama 60 menit.

3.4.2. Pembuatan Media

Tahap pertama dalam pembuatan media adalah pembuatan larutan stok yang terdiri dari stok hara makro, mikro, iron dan vitamin. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS Murashige dan Skoog dengan penambahan Ekstrak Malt dan zat pengatur tumbuh Kinetin dengan konsentrasi 0, 1, 2, 3 dan 4. Pembuatan media sebanyak 1000 ml. Sementara unsur-unsur lain ditimbang sesuai kebutuhan seperti hara makro, sukrosa dan agar. Universitas Sumatera Utara Larutan MS dibuat dengan cara memasukkan hara makro, mikro, iron vitamin, dan sukrosa ke dalam gelas ukur yang ditambahkan akuades hingga 1000 ml kemudian larutan dibagi ke dalam 5 perlakuan yang setiap perlakuannya berisi 200 ml. Kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh kinetin sesuai dengan perlakuan. NAA 0.05 mgl serta Ekstrak Malt ke dalam masing-masing perlakuan. Derajat keasaman pH larutan diukur setiap perlakuan dengan menggunakan pH meter sebesar 5,8. Agar yang telah ditimbang sebanyak 3,5 g dimasukkan ke dalam masing-masing perlakuan yang berfungsi sebagai pemadat. Lalu media dimasak sampai mendidih. Larutan dituang ke dalam botol kultur steril yang kemudian ditutup dengan aluminium foil, dan diikat dengan karet. Selanjutnya, di autoklaf pada suhu 121 C dengan tekanan 15 Psi selam 30 menit. Lalu botol kultur yang berisi media tersebut diletakkan di ruang kultur untuk menghindari kontaminasi Reinert Bajaj, 1989.

3.4.3 Sterilisasi Kotiledon

Eksplan berupa kotiledon jeruk keprok dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit. Kotiledon jeruk keprok direndam dalam larutan dithane 0,2 g100 ml yang ditambah tween 20 sebanyak 2 tetes dan dishaker selama 2 jam. Selanjutnya kotiledon direndam dengan alkohol 70 selama 1 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril. Kotiledon disterilkan dengan larutan pemutih dengan bahan aktif NaOH 5 selama 5 menit, dibilas 3 kali dengan akuades steril dan selanjutnya dengan larutan pemutih 2,5 selama 5 menit. Kotiledon dicuci dengan akuades steril. Selanjutnya kotiledon diletakkan di dalam cawan petri dan dikeringkan dengan kertas saring steril.

3.4.4. Penanaman Kotiledon

Penanaman eksplan dilakukan di dalam entkas yang telah steril dengan di sinari Ultraviolet UV. Botol-botol berisi media yang sudah disterilkan, dibuka tutupnya dengan menggunakan pinset yang sudah dicelupkan pada alkohol dan telah dibakar. Lampu bunsen disediakan untuk mencegah kontaminasi. Setelah tutup botol dibuka, Universitas Sumatera Utara bagian sekitar tutup botol dilewatkan di atas api bunsen untuk memperkecil kontaminasi. Eksplan yang telah disterilkan, diambil dari dalam cawan petri, disayat dan dimasukkan kedalam botol kutur dengan menggunakan pinset steril. Botol kultur ditutup dengan aluminium foil dan disusun dirak kultur. a b c Gambar 3.4.4. Proses Penanaman Kotiledon pada Media dimana a. Media MS;

b. Proses penanaman kotiledon pada media di dalam entkas; c. Media berisi eksplan

3.4.5. Pemeliharaan Kultur Jeruk

Eksplan yang telah ditanam didalam botol kultur diletakkan pada rak pemeliharaan dengan kondisi ruangan yang steril, suhu berkisar 25 o C. Intensitas cahaya dengan penyinaran lampu neon 500 lux. Botol-botol yang berisi eksplan tersebut disusun dengan rapi sehingga memudahkan dalam pengamatan. Diupayakan ruangan dalam keadaan steril atau dengan menyemprotkan akohol 70 setiap harinya.

3.5. Parameter Pengamatan

Pengamatan dilakukan 4 kali dengan interval waktu 1 minggu. Pada awal kultur dilakukan penimbangan berat awal kultur. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah : a. Berat Planlet gram b. Tinggi Tunas cm c. Panjang Akar cm Universitas Sumatera Utara d. Jumlah Akar e. Jumlah Daun f. Persentase Kultur Yang Hidup Jumlah eksplan yang hidup Persentase kultur yang hidup = X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan g. Persentase kontaminasi keseluruhan Persentase kultur terkontaminasi dihitung setiap hari sejak awal hingga akhir penelitian Jumlah eksplan yang terkontaminasi Persentase terkontaminasi = X 100 Jumlah eksplan seluruh perlakuan h. Pengamatan mikroskopik preparat akar planlet pada setiap minggu pengamatan

3.6. Analisis Data