κ-Carrageenase gene was expressed with similar level in transgenic Kappaphycus alvarezii.
Key words: gene expression analysis, cycle of threshold, qrt-PCR
5.1 Pendahuluan
Penggunaan teknologi transgenesis untuk memproduksi rumput laut Kappaphycus alvarezii yang memiliki karakter tertentu yang diinginkan,
merupakan peluang efektif dan strategis. Kemajuan terbaru dalam teknologi transfer gen tersebut memiliki potensi sangat besar untuk pengembangan rumput
laut K. alvarezii transgenik yang membawa gen penyandi enzim κ-Carrageenase
yang berperan dalam sintesis karagenan. Hal ini menjadi salah satu alternatif dalam upaya peningkatan kandungan karagenan.
Tahapan transgenesis yang penting berikutnya dalam rangka perakitan rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik, adalah pemeliharaan lanjut dari
eksplan transgenik dan analisis ekspresi gen pada level RNA. Adanya ekspresi messenger RNA mRNA gen yang ditransfer menunjukkan potensi tinggi
diperoleh karakter yang diinginkan pada organisme transgenik. Pengamatan ekspresi gen dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya menggunakan
gen reporter sebagai indikator pengamatan ekspresi sementaranya Alimuddin 2003; Her et al. 2004; Kato et al. 2007. Ekspresi gen juga dapat dianalisis dengan
cara mengukur level mRNA dan protein. mRNA dari gen asing dapat dideteksi dengan menggunakan probe dengan melabel fragmen DNA dengan radioaktif, dan
protein dengan cara immunodeteksi dengan menggunakan antibodi Alimuddin et al. 2003.
Metode analisis ekspresi gen lainnya yang berkembang sekarang adalah menggunakan teknik RT-PCR. Reverse transkripsi dikombinasikan dengan
polymerase chain reaction RT-PCR telah terbukti menjadi metode yang tepat untuk mengukur ekspresi gen Horikoshi et al. 1992. Teknologi real time PCR
telah diadaptasi untuk melakukan quantitative Real Time-PCR qrt-PCR.
Strategi kuantifikasi ekspresi gen target menggunakan metode qrt-PCR, pada beberapa artikel ilmiah antara lain menyebutkan sebagai kuantifikasi mutlak
absolut, relatif, ataupun komparatif Pfaffl, 2004. Metode untuk menganalisis data untuk mengukur perubahan relatif ekspresi gen menggunakan persamaan 2
- ΔΔCт
telah dilakukan Schmittgen et al. 2000, sedangkan kuantifikasi komparatif adalah kuantifikasi rasio yang menggambarkan ekspresi gen target dibandingkan
kapasitas inang mengekspresikan gen kontrol internal house keeping gene. Pada penelitian ini dilakukan analisis tingkat ekspresi mRNA gen
κ- Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii transgenik menggunakan metode qrt-
PCR dengan membandingkan ekspresi gen κ-Carrageenase dengan gen Actin
sebagai kontrol internal.
5.2 Metode Penelitian
5.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Pembesaran eksplan-tunas Kappaphycus alvarezii transgenik dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, dan analisis ekspresi dilaksanakan di
Laboratorium Biorin PPSHB-IPB. Tahap ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2015 sampai April 2016.
5.2.2 Pemeliharaan Lanjut EksplanTunas K. alvarezii Transgenik
Dua eksplan yang tunasnya telah positif membawa gen κ-Carrageenase dari
hasil analisis DNA pada tahap sebelumnya, dan 14 eksplan kandidat transgenik lainnya serta 14 eksplan kontrol, selanjutnya dipelihara pada wadah pemeliharaan
semi steril. Pemeliharaan dilakukan mengacu metode Sulistiani et al. 2011 dengan beberapa modifikasi, menggunakan media air laut air laut steril salinitas
30-32 gL, diperkaya dengan Provasoli enriched seawaterPES Lampiran 1. Pemeliharaan lanjut semi steril menggunakan botol kerucut volume 1500 ml yang
dilengkapi dengan aerasi Lampiran 4, pada suhu ruangan 26-28 °C. Eksplan transgenik positif PCR DNA masing-masing satu ekplan per botol, sedangkan
eksplan kandidat transgenik lainnya serta kontrol sebanyak tiga eksplan per botol. Pergantian air dilakukan setiap dua minggu, selama delapan bulan pemeliharaan.
5.2.3 Analisis Ekspresi Gen
κ-Carrageenase dengan q-PCR
Ekstraksi RNA total
RNA total diekstraksi dengan menggunakan TRIzol
®
Reagent Invitrogen USA. Dua tunas transgenik dan satu tunas non-transforman kontrol diambil
sebagai sampel, sebanyak 10-25 mg per sampel tunas. Sampel digerus dalam nitrogen cair sampai halus, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml
yang berisi 800 l trizol reagent dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 5 menit
agar sampel dapat terlisis sempurna. Sampel ditambahkan dengan β00 l
kloroform kemudian dihomogenisasi dengan vorteks dan dibiarkan pada suhu ruang selama 2-3 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm suhu
4 °C selama 10 menit, kemudian supernatan yang terbentuk dipindahkan ke dalam tabung mikro baru yang telah berisi dengan 500
L iso-propanol. Sampel dihomogenkan dengan membolak-balikkan tabung mikro secara perlahan
kemudian disimpan dalam suhu ruangan selama 5-10 menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 10 menit. Supernatan dibuang,
sedangkan pelet dilarutkan dalam 500 l etanol 70 dingin dan kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm suhu 4 °C selama 5 menit. Supernatan dibuang, dan selanjutnya pelet dalam tabung mikro dikering-udarakan
menggunakan vacum dryer. Pelet RNA dilarutkan dengan DEPC water 0,1, kemudian disimpan dalam oven 55-57 °C selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan
pengecekan pita RNA dengan elektroforesis. S
ebanyak 50 l RNA total digunakan untuk menyintesis cDNA.
Síntesis cDNA dengan RT-PCR
Sampel RNA terlebih dahulu dibersihkan dari sisa-sisa DNA dengan menambahkan 1,γ l reaksi DNase DNase, buffer DNase, kemudian
didenaturasi pada suhu 25 °C selama 5 menit. Selanjutnya di tambahkan EDTA 1 l dan didenaturasi lagi pada suhu 65 °C selama 10 menit, kemudian disimpan di
atas es selama 5 menit. Sintesis DNA komplementer complementary DNA, cDNA dilakukan dengan menggunakan Iscript
TM
cDNA synthesis kit BIORAD
USA dengan teknik reverse transcriptase PCR RT-PCR .
Cetakan RNA sebanyak 5 l ditambahkan 5x Iscript mix 2 l, Iscript-RT 0,5 l dan nuclease free
water 2,5 l sehingga volume akhir menjadi 10 l. Program PCR dilakukan pada suhu 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 30 menit, 85 °C selama 5 menit, hold
pada suhu 4 °C. Hasil cDNA diambil sebanyak 2
l untuk dikuantifikasi konsentrasinya menggunakan mesin Nanodrop-2000 Thermo scientific.
Kuantifikasi Ekspresi Gen dengan qPCR
Kuantifikasi tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase κ-Car pada rumput laut
Kappaphycus alvarezii transgenik dilakukan dengan quantitative polymerase chain reaction qPCR. cDNA gen
κ-Car diamplifikasi dengan primer spesifik κ- Car-F
5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-γ’ dan κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC CGT CAA CG-
γ’. Primer spesifik κ-Car didesain berdasarkan sekuen
κ-Car dengan posisi sekuen ke 630 untuk forward dan sekuen ke 705 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 98 bp. Gen aktin digunakan
sebagai kontrol internal dengan primer Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG
AGG GTTA- γ’ dan Actin-R 5’-GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-γ’. Primer
spesifik Actin didesain berdasarkan sekuen Actin K. alvarezii kode akses bank gen JQ013141.1 dengan posisi sekuen ke 247 untuk forward dan sekuen ke 325
untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 99 bp.
Analisis q-PCR dilakukan menggunakan mesin NANOBIOSYS UltraFast Real Time PCR G2-4 dan SYBR Green Real Time PCR Kit NANOBIOSYS
Korea. Komposisi reaksi qPCR untuk masing-masing pasangan primer κ-Car
dan Actin yaitu 1 µl cDNA konsentrasi 75 ngµl, 0,25 µl primer forward dan reverse konsentrasi 10 pmolµl, 5 µl SYBR Green dan nuclease free water 3,5 µl,
sehingga total volume menjadi 10 µl. Program qPCR yang digunakan sama untuk primer
κ-Car dan Actin, yaitu pradenaturasi pada 95 °C selama 3 menit, denaturasi pada 94 °C selama 10 detik, penempelan primer dan elongasi pada
55 °C selama 40 detik. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus. Kuantifikasi tingkat ekspresi gen target dilakukan berdasarkan rasio ekspresi
cDNA gen κ-Car sebagai gen target terhadap ekspresi gen Actin K. alvarezii
sebagai kontrol internal jumlah mRNA digunakan dalam sintesis cDNA Pfaffl, 2004. Perhitungan rasio ekspresi gen dilakukan dengan membandingkan nilai C
т Cycle of Threshold dari ekspresi gen
κ-Car dan gen Actin.
5.3 Hasil dan Pembahasan
5.3.1 Pemeliharaan Lanjut EksplanTunas K. alvarezii Transgenik
Hasil pemeliharaan eksplantunas pada wadah pembesaran semi steril, menunjukkan pertambahan ukuran panjang tunas dan jumlah tunas baru, seperti
disajikan pada Tabel 3 danGambar 16. Pertumbuhan panjang telah mencapai 18 mm pada beberapa tunas, sedangkan jumlah tunas telah tumbuh 3-4 tunas baru
pada beberapa eksplan. Hasil ini menunjukkan bahwa perkembangan eksplan telah mengalami pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan pada wadah
pemeliharaan steril pada botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan pada penelitian tahap sebelumnya Gambar 14 dan Tabel 2.