Pembuatan Vektor Ekspresi pMSH κ-Car

Setelah proses transformasi, berlangsung integrasi plasmid rekombinan di dalam sel inang bakteri Escherichia coli DH5α, selanjutnya plasmid target bereplikasi seiring replikasi sel E. coli DH5α. Vektor bereplikasi menghasilkan banyak salinan atau turunan yang identik dan pada proses yang sama selain vektor menggandakan diri juga menggandakan plasmid gen yang dibawanya.

3.3.3 Identifikasi Agrobacterium tumefaciens Transforman

Uji keberhasilan konjugasi dengan metode tri-parental mating TPM untuk transformasi pMSH κ-Car ke Agrobacterium tumefaciens ditunjukkan pada Gambar 11. Pada kultur tunggal, ketiga bakteri tidak tumbuh Gambar 11B, sedangkan bakteri A. tumefaciens yang dikonjugasi dan diinkubasi pada media selektif berhasil tumbuh Gambar 11A. Gambar 11 Koloni A. tumefaciens transforman hasil konjugasi dapat tumbuh pada media selektif tanda panah yang mengindikasikan proses tri- parental matingTPM berhasil dilakukan A, sedangkan kultur tunggal masing-masing: Escherichia coli DH5αdonor 1, E. coli DH1 pRK2013helper 2, Agrobacterium tumefaciensresipien 3 tidak tumbuh pada media selektif, sebagai kontrol negatif B Agrobacterium tumefaciens transforman mampu tumbuh di media selektif yang ditambahkan antibiotik marka seleksi kanamisin, higromisin dan streptomisin, karena selain memiliki gen marka seleksi sendiri streptomisin, juga telah membawa gen marka seleksi kanamisin dan higromisin yang terdapat pada konstruksi pMSH κ-Car. Sementara kultur tunggal donor, helper dan resipien tidak dapat tumbuh, karena donor E. coli DH5α maupun helper E. coli DH1 pRK2013 hanya membawa gen marka seleksi kanamisin dan higromisin saja, tetapi tidak membawa marka seleksi streptomisin. Demikian juga resipien A. tumefaciens sebelum konjugasi yang hanya membawa marka seleksi streptomisin tetapi tidak membawa marka seleksi kanamisin dan higromisin. Bakteri yang mampu tumbuh pada media selektif, hanya A. tumefaciens hasil konjugasi yang telah mengandung gen insersi Wise et al. 2006, dalam hal ini plasmid pMSH κ-Car. Dengan demikian, hasil tersebut menunjukkan bahwa proses transformasi pMSH κ-Car ke A. tumefaciens telah berhasil dilakukan. Gambar 12 Master plate replika koloni A. tumefaciens transforman A, dan elektroforegram amplikon PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R dengan fragmen berukuran sekitar 2.000 bp B. Tanda kepala panah di sebelah kanan Gambar 12B menunjukkan ukuran produk amplikon PCR, M: marka gene ruler 1kb DNA ladder, K+: plasmid pMSH κ-Kar sebagai kontrol positif, K-: koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif Hasil analisis PCR disajikan pada Gambar 12B, dengan cetakan DNA dari koloni A. tumefaciens yang tumbuh pada media selektif Gambar 12A. Produk PCR dengan primer 35S-F dan tNos-R 2.000 bp, Gambar 12B, sama dengan total ukuran sekuen promoter 35S, gen κ-Car, dan tNos Gambar 8. Hasil ini mendukung hasil identifikasi transforman melalui uji pada media selektif. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa proses transformasi konstruksi gen pMSH κ- Car berhasil dilakukan ke A. tumefaciens. Mekanisme konjugasi bakteri donor dan resipien pada proses TPM dimulai dengan sel donor memproduksi pilus, kemudian penempelan pilus ke sel resipien dan membawa dua sel secara bersamaan. Perpindahan plasmid berlangsung setelah pemotongan oleh enzim endonuklease menjadi untai tunggal dan selanjutnya ditansfer ke sel resepien. Kedua sel menyintesis dan melengkapi untai tunggal menjadi untai ganda membentuk plasmid sirkular kembali dan juga memproduksi pili, akhirnya kedua sel menjadi donor yang viabel Clewell 1993, Liberty et al. 2008.

3.3.4 Pengurutan DNA dan Analisis Kesejajaran Gen κ-Carrageenase

Pengurutan DNA dan analisis kesejajaran gen κ-Carrageenase κ-Car berdasarkan urutan nukleotida dengan data gen di gene bank dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool BLAST menunjukkan bahwa fragmen κ-Car mempunyai kesamaan 76 dengan a carrageenovora genes cgkA and cgkB, dan 76 dengan Pseudoalteromonas tetraodonis cgk-k142a gene for kappa-carrageenase, serta 73 dengan Pseudoalteromonas sp. LL1 kappa-carrageenase gene Tabel 1. Hasil analisis pensejajaran menunjukkan kesamaan sekuen 73-76 fragmen gen κ-Carrageenase produk PCR dengan urutan nukleotida gen κ- Carrageenase yang telah diisolasi dari sumber lainnya yang ada di bank gen. Hasil ini juga menguatkan bahwa fragmen κ-Carrageenase yang ditransformasi ke vektor adalah sesuai yang diharapkan.