4 TRANSFORMASI GEN KAPPAΚ-CARRAGEENASE
PADA RUMPUT LAUT Kappaphycus alvarezii
ABSTRAK Teknik transformasi gen asing telah diaplikasikan untuk meningkatkan karakter
penting pada organisme akuatik. Sebagai langkah awal menuju peningkatan kandungan kappa
-karagenan, dalam penelitian ini gen κ-Carrageenase κ-Car ditransformasi ke rumput laut Kappaphycus alvarezii melalui mediasi
Agrobacterium tumefaciens. Pada penelitian ini digunakan konstruksi plasmid biner pMSH pMSH
κ-Car yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV 35S dan terminator Nos tNos. Analisis DNA untuk identifikasi K. alvarezii
transgenik dilakukan dengan metode PCR menggunakan dua set primer. Hasil pemeliharaan eksplan pascatransformasi menunjukkan bahwa 36 eksplan lulus
hidup dan bertunas sebesar 88,9, dan 100 dari jumlah tunas yang disampling membawa gen
κ-Car. Ukuran fragmen DNA produk PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R adalah 2.000 bp, ukuran sama dengan produk PCR dari kontrol
positif dengan cetakan plasmid pMSH κ-Car, sementara tidak ada produk
amplifikasi pada K. alvarezii non-transformasi kontrol negatif. Selanjutnya, analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R menunjukkan produk
amplifikasi 300 bp, ukuran yang sama seperti sekuen promotor 35S CaMV. Dengan demikian, K. alvarezii transgenik yang membawa
κ-Car telah dihasilkan.
Keywords: gen Kappa
κ-Carrageenase, Kappaphycus alvarezii, transformasi gen
TRANSFORMATION OF KAPPA κ-CARRAGEENASE GENE
TO SEAWEED Kappaphycus alvarezii
ABSTRACT Foreign gene transformation techniques have been applied to improve the
valuable traits of farmed organism. As the first step towards increasing of kappa -carrageenan content, in this study κ-Carrageenase gene κ-Car was
transferred into K. alvarezii by mediation of Agrobacterium tumefaciens. The pMSH
κ-Car binary plasmid construct controlled by 35S CaMV promoter 35S and Nos terminator tNos was used in this study. DNA analysis to identify the
transgenic was conducted by PCR method using two sets of primer. The result showed that 36 transformed explants were survived, 88.9 sprouted and 100
of the sprouted explants were having the κ-Car gene. The size of amplified DNA
fragment from K. alvarezii transgenic using 35S-F and tNos-R set primers was 2,000 bp, the same size as PCR product of the template of pMSH
κ-Car plasmid, while no amplification product in non-transformated explants negative control
was found. Furthermore, PCR analysis using 35S-F and 35S-R set primers showed amplification product of 300 bp, the same size as the length of 35S CaMV
promoter sequence. Thus, K. alvarezii transgenic carrying κ-Car had been
generated. Keywords: gene transformation, Kappaphycus alvarezii, K
appaκ-Carrageenase gene
4.1 Pendahuluan
Rumput laut Kappaphycus alvarezii termasuk kelompok alga merah Rhodophyceae Doty 1987 dengan produk utama berupa hidrokoloid kappa
- karagenan Neish 2005a. Karagenan memiliki kegunaan sangat luas bagi industri
McHugh 2003 sehingga diprediksi kebutuhan karagenan akan terus meningkat di masa datang.
-karagenan dalam tubuh K. alvarezii merupakan bentuk akhir dari bentuk prekursornya, µ-karagenan Campo et al. 2009. Pembentukan
-karagenan dikendalikan oleh enzim sulfohidrolase
κ-Carrageenase. Studi molekuler terkait biosintesis -karagenan pada rumput laut K. alvarezii belum banyak dilakukan.
Gen κ-Carrageenase telah berhasil diisolasi dari beberapa organisme laut,
yakni Pseudoalteromonas
carrageenovora Michel
et al.
2001, -Proteobacterium, Pseudomonas elongata syn, Microbulbifer elongatus comb.
Nov. Khambhaty et al. 2007, Pseudoalteromonas-like bacterium Zhou et al. 2008,
marine bacterium:
Alteromonadaceae, Marinimicrobium,
dan Microbulbifer Tayco et al. 2013. Bakteri memiliki struktur sel lebih sederhana
dan ukuran genom lebih kecil sehingga banyak dijadikan sumber gen, karena isolasi lebih mudah dan tingkat keberhasilan lebih tinggi.
Teknologi transgenesis diaplikasikan untuk memodifikasi genetik pada genom inang secara terarah berupa penyisipan gen asing yang menyandikan
karakter tertentu dan dapat memprediksi sifat-sifat baru yang akan muncul pada inang hasil rekayasa Yuwono 2006; Lutz 2001.
Aplikasi transgenesis pada rumput laut makroalga memperlihatkan potensi besar dimasa mendatang Hallmann 2007; Walker et al. 2005, misalnya untuk
peningkatan ketahanan dari cekaman lingkungan dan resistensi terhadap penyakit. Hingga saat ini penelitian transfer gen pada makroalga telah berhasil dilakukan,
antara lain: Porphyra yezoensis Cheney et al. 2001 dan Laminaria japonica Li et al. 2009 menggunakan gen
β-glucuronidase GUS; serta Gracilaria dengan gen LacZ Huddy et al. 2012. Pada K. alvarezii telah sukses dilakukan transfer
gen green fluorescent protein GFP menggunakan promoter berbeda Rajamuddin et al. 2014; gen LacZ Wang et al. 2010; gen PaCS penyandi
sitrat sintase Daud et al. 2013; gen lisozim-c Handayani et al. 2014; dan gen Metallothionein tipe II Fajriah et al. 2014.
Pembuatan K. alvarezii transgenik oleh Rajamuddin et al. 2014 menggunakan metode elektroporasi, Wang et al. 2010 menggunakan metode
particle bombardment, sedangkan Daud et al. 2014, Handayani et al. 2014 dan Fajriah et al. 2014 menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens.
Kelebihan transformasi menggunakan A. tumefaciens, diantaranya: jumlah salinan gen lebih banyak dan teknik pengulangan percobaan memberikan hasil serupa
reproducible Hiei et al. 1997; de la Riva et al. 1998.
Penelitian pada tahap ini bertujuan mentransformasi gen yang menyandikan enzim
κ-Carrageenase pada rumput laut K. alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens, dalam rangka meningkatkan kandungan -
karagenan pada K. alvarezii sebagai tujuan akhir.
4.2 Bahan dan Metode 4.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium Biorin, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
PPSHB Institut Pertanian Bogor IPB, mulai bulan Februari 2014 sampai April 2015.
4.2.2 Preparasi Talus dan Sumber Eksplan Steril Kappaphycus alvarezii
Eksplan rumput laut K. alvarezii dikoleksi dari hasil budidaya di perairan Pangkep, Sulawesi Selatan Gambar 13A. Selanjutnya rumput laut diadaptasikan
dalam wadah pemeliharaan terkontrol Gambar 13B di Laboratorium PPSHB- IPB. Preparasi eksplan K. alvarezii steril Gambar 13C mengacu pada metode
Reddy et al. 2003
Gambar 13 Koleksi Kappaphycus alvarezii hasil budidaya sebagai sumber eksplan A, adaptasi pemeliharaan secara terkontrol di laboratorium
B, dan eksplan steril ukuran 7-10 mm, siap digunakan dalam proses transfer gen C
4.2.3 Transformasi Gen κ-Carrageenase pada Kappaphycus alvarezii
Transformasi dilakukan mengikuti metode Cheney 2000 dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 50 eksplan steril K. alvarezii ukuran panjang 7-10 mm,
dilukai menggunakan jarum steril. Eksplan direndam dalam media infeksi yang berisi A. tumefaciens yang membawa gen
κ-Carrageenase pMSHκ-Car OD
600
=0,5-1,0 dan 100 M asetosiringon selama 30 menit dengan
penggoyangan 100 rpm. Selanjutnya eksplan dikering-udarakan dengan tisu steril dan dipindahkan ke media ko-kultivasi media padat
PES dan 100 M asetosiringon selama 3 hari di ruang gelap. Eksplan hasil ko-kultivasi dicuci
dengan cefotaxim 200 mgL, dibilas dengan air laut steril sebanyak 3 kali, dikering-udarakan dengan tisu steril, kemudian eksplan dipelihara di media
recovery PES tanpa asetosiringon selama 7 hari. Modifikasi metode pada penelitian ini, tidak dilakukan skrining eksplan pada media seleksi antibiotik,
untuk meminimalisasi eksplan stres akibat terpapar perlakuan yang terlalu lama. Konsekuensi modifikasi metode tersebut, menyebabkan analisis PCR harus
