Gambar 12 Master plate replika koloni A. tumefaciens transforman A, dan elektroforegram amplikon PCR menggunakan primer 35S-F dan
tNos-R dengan fragmen berukuran sekitar 2.000 bp B. Tanda kepala panah di sebelah kanan Gambar 12B menunjukkan ukuran
produk amplikon PCR, M: marka gene ruler 1kb DNA ladder, K+: plasmid pMSH
κ-Kar sebagai kontrol positif, K-: koloni tanpa transformasi sebagai kontrol negatif
Hasil analisis PCR disajikan pada Gambar 12B, dengan cetakan DNA dari koloni A. tumefaciens yang tumbuh pada media selektif Gambar 12A. Produk
PCR dengan primer 35S-F dan tNos-R 2.000 bp, Gambar 12B, sama dengan total ukuran sekuen promoter 35S, gen
κ-Car, dan tNos Gambar 8. Hasil ini mendukung hasil identifikasi transforman melalui uji pada media selektif. Dengan
demikian dapat disimpulkan bahwa proses transformasi konstruksi gen pMSH κ-
Car berhasil dilakukan ke A. tumefaciens. Mekanisme konjugasi bakteri donor dan resipien pada proses TPM dimulai
dengan sel donor memproduksi pilus, kemudian penempelan pilus ke sel resipien dan membawa dua sel secara bersamaan. Perpindahan plasmid berlangsung
setelah pemotongan oleh enzim endonuklease menjadi untai tunggal dan selanjutnya ditansfer ke sel resepien. Kedua sel menyintesis dan melengkapi untai
tunggal menjadi untai ganda membentuk plasmid sirkular kembali dan juga memproduksi pili, akhirnya kedua sel menjadi donor yang viabel Clewell 1993,
Liberty et al. 2008.
3.3.4 Pengurutan DNA dan Analisis Kesejajaran Gen κ-Carrageenase
Pengurutan DNA dan analisis kesejajaran gen κ-Carrageenase κ-Car
berdasarkan urutan nukleotida dengan data gen di gene bank dengan menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool BLAST
menunjukkan bahwa fragmen κ-Car mempunyai kesamaan 76 dengan a
carrageenovora genes cgkA and cgkB, dan 76 dengan Pseudoalteromonas tetraodonis cgk-k142a gene for kappa-carrageenase, serta 73 dengan
Pseudoalteromonas sp. LL1 kappa-carrageenase gene Tabel 1.
Hasil analisis pensejajaran menunjukkan kesamaan sekuen 73-76 fragmen gen
κ-Carrageenase produk PCR dengan urutan nukleotida gen κ- Carrageenase yang telah diisolasi dari sumber lainnya yang ada di bank gen.
Hasil ini juga menguatkan bahwa fragmen κ-Carrageenase yang ditransformasi
ke vektor adalah sesuai yang diharapkan.
Tabel 1 Analisis kesejajaran
fragmen nukleotida
gen κ-Carrageenase
menggunakan program BLAST No
Aksesi Deskripsi
Skor Query
cover E-
value Kesa-
maan 1
X71620.1 A carrageenovora genes
cgkA and cgkB, partial 608
94 5e-
170 76
2 GU38634
2.1 Pseudoalteromonas
tetraodonis cgk-k142a gene for kappa-carrageenase,
complete cds 579
90 3e-
161 76
3 GU38634
2.1 Pseudoalteromonas sp. LL1
kappa-carrageenase gene, complete cds
281 64
1e-71 73
Bakteri A. tumefaciens transforman yang membawa konstruksi pMSH κ-Car
telah siap digunakan untuk perlakuan ke rumput laut Kappaphycus alvarezii atau rumput laut jenis lainnya untuk pembuatan transgenik. Proses transfer gen pada
rumput laut K. alvarezii, telah dilakukan dengan menggunakan metode elektroporasi Rajamuddin et al. 2014, juga telah dapat dilakukan menggunakan
metode perantara A. tumefaciens Daud et al. 2013; Fajriah et al. 2014; Handayani et al. 2014.
Sebagai kelanjutan dari tahap ini, dilakukan pembuatan Kappaphycus alvarezii transgenik gen
κ-Carrageenase menggunakan metode mediasi A. tumefaciens. Rumput laut yang mengekspresikan gen
κ-Carrageenase diharapkan akan memiliki kandungan kappa-karagenan lebih banyak over-ekspresi daripada
non-transgenik.
3.4 Simpulan
Produk PCR dengan cetakan DNA dari Agrobacterium tumefaciens berukuran sekitar 2.000 bp menunjukkan bahwa konstruksi gen pMSH
κ-Car telah berhasil dibuat, dan Agrobacterium tumefaciens yang membawa konstruksi
gen tersebut telah berhasil diperoleh.
