Identifikasi Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR

USA dengan teknik reverse transcriptase PCR RT-PCR . Cetakan RNA sebanyak 5 l ditambahkan 5x Iscript mix 2 l, Iscript-RT 0,5 l dan nuclease free water 2,5 l sehingga volume akhir menjadi 10 l. Program PCR dilakukan pada suhu 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 30 menit, 85 °C selama 5 menit, hold pada suhu 4 °C. Hasil cDNA diambil sebanyak 2 l untuk dikuantifikasi konsentrasinya menggunakan mesin Nanodrop-2000 Thermo scientific. Kuantifikasi Ekspresi Gen dengan qPCR Kuantifikasi tingkat ekspresi gen κ-Carrageenase κ-Car pada rumput laut Kappaphycus alvarezii transgenik dilakukan dengan quantitative polymerase chain reaction qPCR. cDNA gen κ-Car diamplifikasi dengan primer spesifik κ- Car-F 5’-CCA CTT GCC ATT CGA CCC AAGA-γ’ dan κ-Car-R 5’-CAC CAA CGA TTT CAC CGT CAA CG- γ’. Primer spesifik κ-Car didesain berdasarkan sekuen κ-Car dengan posisi sekuen ke 630 untuk forward dan sekuen ke 705 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 98 bp. Gen aktin digunakan sebagai kontrol internal dengan primer Actin-F 5’-CCG TCC CGA TTT ACG AGG GTTA- γ’ dan Actin-R 5’-GCA TGA GGA GCT TCG CCA TCC-γ’. Primer spesifik Actin didesain berdasarkan sekuen Actin K. alvarezii kode akses bank gen JQ013141.1 dengan posisi sekuen ke 247 untuk forward dan sekuen ke 325 untuk reverse, sehingga target fragmen sekitar 99 bp. Analisis q-PCR dilakukan menggunakan mesin NANOBIOSYS UltraFast Real Time PCR G2-4 dan SYBR Green Real Time PCR Kit NANOBIOSYS Korea. Komposisi reaksi qPCR untuk masing-masing pasangan primer κ-Car dan Actin yaitu 1 µl cDNA konsentrasi 75 ngµl, 0,25 µl primer forward dan reverse konsentrasi 10 pmolµl, 5 µl SYBR Green dan nuclease free water 3,5 µl, sehingga total volume menjadi 10 µl. Program qPCR yang digunakan sama untuk primer κ-Car dan Actin, yaitu pradenaturasi pada 95 °C selama 3 menit, denaturasi pada 94 °C selama 10 detik, penempelan primer dan elongasi pada 55 °C selama 40 detik. Amplifikasi diulang sebanyak 40 siklus. Kuantifikasi tingkat ekspresi gen target dilakukan berdasarkan rasio ekspresi cDNA gen κ-Car sebagai gen target terhadap ekspresi gen Actin K. alvarezii sebagai kontrol internal jumlah mRNA digunakan dalam sintesis cDNA Pfaffl, 2004. Perhitungan rasio ekspresi gen dilakukan dengan membandingkan nilai C т Cycle of Threshold dari ekspresi gen κ-Car dan gen Actin.

5.3 Hasil dan Pembahasan

5.3.1 Pemeliharaan Lanjut EksplanTunas K. alvarezii Transgenik

Hasil pemeliharaan eksplantunas pada wadah pembesaran semi steril, menunjukkan pertambahan ukuran panjang tunas dan jumlah tunas baru, seperti disajikan pada Tabel 3 danGambar 16. Pertumbuhan panjang telah mencapai 18 mm pada beberapa tunas, sedangkan jumlah tunas telah tumbuh 3-4 tunas baru pada beberapa eksplan. Hasil ini menunjukkan bahwa perkembangan eksplan telah mengalami pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan pada wadah pemeliharaan steril pada botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan pada penelitian tahap sebelumnya Gambar 14 dan Tabel 2. Pertambahan ukuran panjang dan jumlah tunas baru dari eksplan transgenik dan kandidat transgenik pada pemeliharaan semi-steril ini, menunjukkan hasil yang relatif sama dengan eksplan pada non-transgenik sebagai kontrol Tabel 3. Demikian pula, selama proses pembesaran secara semi steril, terjadi mortalitas pada beberapa eksplan-tunas, baik pada eksplan transgenik maupun pada eksplan non-transgenik. Tabel 3 Pertumbuhan panjang tunas dan jumlah tunas pada eksplan transgenik, kandidat transgenik dan kontrol hasil pemeliharaan pada kultur pembesaran secara semi-steril Jenis eksplan Jumlah eksplan Jumlah tunaseksplan Panjang tunas mm Awal Akhir Kontrol 14 6 2-3 5-15 Transgenik-1 T1 1 1 2 1. 10 T1 2. 12 Transgenik-2 T2 1 1 2 1. 10 T2 2. 7 Kandidat transgenik lainnya 14 5 2-4 5-18 Keterangan : belum dianalisis PCR Jumlah eksplan awal yang dipelihara pada pembesaran secara semi steril untuk transgenik sebanyak dua eksplan dan kandidat transgenik sebanyak 14 eksplan dan kontrol non-transgenik sebanyak 14 eksplan. Sampai dengan dilakukannya analisis ekspresi gen, jumlah eksplan yang masih hidup untuk transgenik sebanyak dua eksplan, dan kandidat transgenik sebanyak 5 eksplan, sedangkan kontrol non-transgenik sebanyak enam eksplan Tabel 3. Dengan demikian, sintasan eksplan pada pemeliharaan pembesaran semi-steril, untuk eksplan transgenik sebesar 100, dan eksplan kandidat transgenik sebesar 36, sedangkan pada eksplan non-transgenik sebesar 43. Gambar 16 Morfologi perkembangan tunas Kappaphycus alvarezii pada wadah pembesaran semi steril di botol kerucut volume 1500 ml dengan aerasi: 2 tunas A, 3 tunas B dan 4 tunas C