4.2 Bahan dan Metode 4.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium Biorin, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi
PPSHB Institut Pertanian Bogor IPB, mulai bulan Februari 2014 sampai April 2015.
4.2.2 Preparasi Talus dan Sumber Eksplan Steril Kappaphycus alvarezii
Eksplan rumput laut K. alvarezii dikoleksi dari hasil budidaya di perairan Pangkep, Sulawesi Selatan Gambar 13A. Selanjutnya rumput laut diadaptasikan
dalam wadah pemeliharaan terkontrol Gambar 13B di Laboratorium PPSHB- IPB. Preparasi eksplan K. alvarezii steril Gambar 13C mengacu pada metode
Reddy et al. 2003
Gambar 13 Koleksi Kappaphycus alvarezii hasil budidaya sebagai sumber eksplan A, adaptasi pemeliharaan secara terkontrol di laboratorium
B, dan eksplan steril ukuran 7-10 mm, siap digunakan dalam proses transfer gen C
4.2.3 Transformasi Gen κ-Carrageenase pada Kappaphycus alvarezii
Transformasi dilakukan mengikuti metode Cheney 2000 dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 50 eksplan steril K. alvarezii ukuran panjang 7-10 mm,
dilukai menggunakan jarum steril. Eksplan direndam dalam media infeksi yang berisi A. tumefaciens yang membawa gen
κ-Carrageenase pMSHκ-Car OD
600
=0,5-1,0 dan 100 M asetosiringon selama 30 menit dengan
penggoyangan 100 rpm. Selanjutnya eksplan dikering-udarakan dengan tisu steril dan dipindahkan ke media ko-kultivasi media padat
PES dan 100 M asetosiringon selama 3 hari di ruang gelap. Eksplan hasil ko-kultivasi dicuci
dengan cefotaxim 200 mgL, dibilas dengan air laut steril sebanyak 3 kali, dikering-udarakan dengan tisu steril, kemudian eksplan dipelihara di media
recovery PES tanpa asetosiringon selama 7 hari. Modifikasi metode pada penelitian ini, tidak dilakukan skrining eksplan pada media seleksi antibiotik,
untuk meminimalisasi eksplan stres akibat terpapar perlakuan yang terlalu lama. Konsekuensi modifikasi metode tersebut, menyebabkan analisis PCR harus
dilakukan satu per satu terhadap tunas-tunas yang tumbuh dari eksplan hasil transformasi.
4.2.4 Pemeliharaan Eksplan Kappaphycus alvarezii Pascatransformasi
Eksplan hasil transformasi dipelihara sampai keluarnya tunas-tunas baru, pemeliharaan eksplan pascatransformasi mengacu metode Sulistiani et al. 2012
dan Rajamuddin et al. 2010. Media dasar pemeliharaan menggunakan air laut steril salinitas 30-32 gL, diperkaya dengan Provasoli enriched seawaterPES
Lampiran 1 Provasoli 1968. Pemeliharaan dilakukan secara steril pada suhu ruangan 24-26 °C menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan
penggoyangan 100 rpm Lampiran 2, sebanyak 5 eksplan per botol. Selama pemeliharaan dilakukan pergantian media setiap tiga minggu, dengan lama
pemeliharaan empat bulan. Tunas-tunas baru yang tumbuh dianalisis DNA untuk identifikasi eksplan transgenik yang membawa gen
κ-Carrageenase.
4.2.5 Analisis DNA Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR
Sebanyak dua eksplan K. alvarezii yang telah tumbuh tunas baru dan sudah memenuhi syarat ukuran untuk analisis DNA sekitar 0,1 g. Masing-masing satu
tunas dari dua eksplan hasil transformasi, dipotong sebanyak 0,1 g untuk ekstraksi DNA menggunakan bufer ektraksi CTAB Lampiran 3 mengikuti metode Doyle
Doyle 1987.
Amplifikasi PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F μ 5’-ATG GCT
GGA GTA TTA GCT GGG- γ’ dan tNos-Rμ 5’-CTC ATA AAT AAC GTC ATG
CAT TAC A- γ’ Hannum 2012. Verifikasi PCR DNA K. alvarezii transgenik
juga dilakukan menggunakan primer 35S-F: 5 ’-AAA CCT CCT CGG ATT CCA
TT- γ’ dan 35S-R: 5’-GAA GGG TCT TGC GAA GGA TA-3’ Suharsono et al.
2002. Program PCR yang digunakan adalah pradenaturasi pada suhu 95 °C selama
5 menit, 30 siklus amplifikasi yang terdiri atas denaturasi pada suhu 94 °C selama 30 detik, annealing pada suhu 56 °C selama 1 menit, dan extention pada suhu
72 °C selama 2 menit, serta final extention pada suhu 72 °C selama 5 menit dan pendinginan pada 20 °C selama 10 menit. Sebanyak 10-
15 l produk PCR diseparasi dengan elektroforesis 100 V selama 30 menit pada 1 agarosa dalam
buffer TAE 1x stok TAE 50x terdiri dari: 4,84 g Tris base, 1,14 mL Acetic acid glacial, 2 mL EDTA pH 8 0,5 M, 800 mL ddH
2
O. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan gel documentation system-UV translluminator.
4.3 Hasil dan Pembahasan
4.3.1 Pertumbuhan Eksplan Kappaphycus alvarezii Pascatransformasi
Hasil pertumbuhan eksplan hasil perlakuan transformasi disajikan pada Tabel 2. Persentase eksplan yang hidup pascatransformasi 36 dan bertunas
persentase eksplan bertunas adalah 88,9. Hasil ini menunjukkan bahwa pada eksplan dengan perlakuan transformasi,
mortalitas tinggi hanya terjadi pada tahap penginfeksian sampai dengan ko-
