kultivasi, sedangkan pada pascatransformasi tingkat kelangsungan hidup eksplan relatif sama dengan kontrol. Persentase eksplan hidup pascatransformasi 36
dan persentase eksplan bertunas 88,9 pada penelitian ini, lebih tinggi dari beberapa hasil penelitian sebelumnya, sebesar: 27,4 Fajriah et al. 2014, 23,6
Handayani et al. 2014, dan 7,5 Daud et al. 2013.
Tabel 2 Persentase eksplan hidup dan bertunas dari eksplan Kappaphycus alvarezii hasil perlakuan transformasi gen
κ-Carrageenase κ-Car Parameter
yang diamati Perlakuan
Trans- formasi
Kontrol tanpa transformasi
a. Jumlah eksplan awal
50 50
b. Jumlah eksplan hidup pascatransformasi
18 46
c. Persentase eksplan hidup pascatransformasi
ba x 100 d.
Jumlah eksplan hidup dan bertunas e.
Persentase eksplan hidup dan bertunas db x 100
36 16
88,9 92
40
87 Tingginya persentase eksplan hidup dan bertunas yang diperoleh pada
penelitian ini dibandingkan hasil yang diperoleh dari tiga penelitian sebelumnya, disebabkan karena modifikasi metode transformasi, di mana setelah perlakuan ko-
kultivasi tidak dilakukan skrining pada media seleksi antibiotik sehingga eksplan tidak mengalami stres dalam rentang waktu yang lama.
Tunas-tunas yang tumbuh Gambar 14B dari eksplan hasil transformasi Gambar 14A, telah berukuran sekitar 5-10 mm selama kurun waktu empat bulan
pemeliharaan pada wadah pemeliharaan secara steril menggunakan botol kultur volume 200 ml dengan penggoyangan.
Gambar 14 Eksplan Kappaphycus alvarezii awal transformasi gen κ-
Carrageenase A, dan eksplan umur empat bulan pascatransformasi yang memiliki tunas baru dengan ukuran panjang 5-10 mm
lingkaran merah B
4.3.2 Identifikasi Rumput Laut K. alvarezii Transgenik dengan PCR
Hasil ekstraksi genom rumput laut K. alvarezii disajikan pada Gambar 15A, yang menunjukkan bahwa ekstraksi genom berhasil dilakukan baik pada
K. alvarezii hasil transformasi maupun kontrol. Dengan membandingkan pita DNA marka lambda γ0 ng l dan 50 ng l, konsentrasi DNA genom hasil
ekstraksi dari K. alvarezii adalah berkisar 30-40 ng l.
Hasil analisis PCR terhadap K. alvarezii transgenik disajikan pada Gambar 15B dan Gambar 15C. Dengan menggunakan primer 35S-F dan tNos-R, hasil
PCR menunjukkan produk sekitar 2.000 bp pada K. alvarezii transgenik T1 dan T2, sedangkan pada K. alvarezii kontrol non-transforman NT tidak ada produk
amplifikasi Gambar 15B. Ukuran produk PCR tersebut konsisten dengan ukuran vektor pMSH
κ-Car K+. Untuk konfirmasi lebih lanjut, PCR dilakukan menggunakan primer 35S-F dan 35S-R, dan hasil amplifikasi menunjukkan
adanya pita DNA berukuran sekitar 300 bp Gambar 15C. Ukuran produk PCR tersebut sesuai dengan ukuran fragmen promoter 35S pada vektor pMSH
κ-Car. Kedua hasil PCR Gambar 15B dan Gambar 15C tersebut mengindikasikan
kesuksesan transformasi dan K. alvarezii transgenik berhasil diproduksi. Pada penelitian ini, dari 16 eksplan yang hidup dan bertunas, telah
disampling 2 tunas untuk analisis PCR, dan dari dua sampel yang diperiksa tersebut semuanya 100 positif PCR transgenik. Sementara itu, Handayani et
al. 2014 melaporkan tiga dari enam putatif transforman 50 positif PCR, dan Fajriah et al. 2014 melaporkan 13 dari 135 putatif transforman 9,63 adalah
transgenik.
Gambar 15 Hasil ekstraksi DNA genom rumput laut Kappaphycus alvarezii A, analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan tNos-R dengan produk
berukuran sekitar 2.000 bp B, dan analisis PCR menggunakan primer 35S-F dan 35S-R dengan produk sekitar 300 bp C. G:
genom; -3 dan -5: marka dengan konsentrasi 30 ngµl dan 50 ngµl BioLabs, Inc. New England; T1 dan T2: K. alvarezii transgenik;
NT: K. alvarezii kontrol non-transformasi; K
+: plasmid pMSH κ-
Car sebagai kontrol positif,
M: m arker gen ruler 1KB DNA ladder
BioLabs, Inc. New England; tanda kepala panah menunjukkan target produk PCR
GNT
κ-car
GT1 GT2
λ-3 λ-5
A
Hasil penelitian transformasi gen pada K. alvarezii lainnya dilaporkan Alizadeh et al. unpublish dengan metode transformasi yang sama menghasilkan
persentase transformasi sebesar 20 menggunakan gen GUS dan promoter 35S. Wang et al. 2010 menghasilkan persentase transformasi lebih tinggi sebesar
33 tetapi dengan metode berbeda yaitu micro-particle bombardment pada tekanan 450 psi, menggunakan gen LacZ dan promoter SV40.
Tingginya persentase transformasi pada penelitian ini 100 karena analisis PCR baru dilakukan secara acak pada dua sampel tunas, dan belum
dilakukan pada semua tunas dari eksplan hasil transformasi. Dua tunas tersebut telah memenuhi ukuran untuk syarat minimum sampel ekstraksi DNA sebanyak
0,1 g Doyle dan Doyle 1987. Mengacu hasil analisis PCR tersebut, dimana dari dua sampel dan semuanya transgenik, maka peluang lebih besar tunas-tunas
lainnya juga merupakan transgenik.
Faktor-faktor yang juga berperan dalam kesuksesan transformasi gen menggunakan mediasi A. tumefaciens adalah penambahan asetosiringon,
kepadatan bakteri A. tumefaciens dan waktu kokultivasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
penambahan 100 M asetosiringon dengan OD 0,5-1,0 dengan lama masa infeksi 30 menit telah menghasilkan persentase transformasi
yang baik pada penelitian ini. Menurut James et al. 1993, penambahan asetosiringon ke dalam media infeksi dan media kokultivasi, efektif meningkatkan
efisiensi transformasi. Penambahan asetosiringon mampu menginduksi gen vir yang berfungsi mentransfer T-DNA ke dalam sel tanaman dan mempertinggi
efektivitas infeksi A. tumefaciens sehingga meningkatkan jumlah sel transforman Rashid et al. 2010. Selain itu, perlakuan lama ko-kultivasi inkubasi antara
bakteri dan eksplan sangat mempengaruhi efektivitas infeksi bakteri. Inkubasi yang terlalu cepat dapat mempengaruhi keberhasilan transformasi, karena bakteri
belum sempat menginfeksi sel-sel eksplan secara sempurna. Menurut Alimohammadi Bagherieh-Najjar 2009 bahwa keberhasilan transfer gen oleh
A. tumefaciens sangat ditentukan oleh ada tidaknya luka perlukaan, kerapatan bakteri optical density, lama inokulasi dan lama kokultivasi.
Pada tahap penelitian ini, ukuran tunas-tunas dari eksplan hasil transformasi masih relatif kecil. Oleh karena itu, diperlukan pemeliharaan lebih lanjut agar
diperoleh tunas lebih banyak untuk analisis ekspresi dan integrasi gen.
4.4 Simpulan
Gen κ-Carrageenase telah berhasil ditransformasi ke rumput laut
Kappaphycus alvarezii menggunakan metode mediasi Agrobacterium tumefaciens. Persentase eksplan hidup pascatransformasi sebesar 36 dan bertunas 88,9,
lebih tinggi dari penelitian-penelitian sebelumnya, dengan persentase transgenik sebesar 100.
