Kebaruan Penelitian Novelty Transformasi Gen Kappa(Κ) Carrageenase Pada Rumput Laut Kappaphycus Alvarezii

sitoplasma sel inang, 6 Vir E2 berasosiasi dengan utas T-DNA dan bergerak menuju sitoplasma sel inang, 7 kompleks T-DNA dimasukkan ke dalam inti sel inang melalui proses impor aktif dan 8 di dalam inti, T-DNA dibawa menuju ke titik tempat integrasi DNA pada kromoson, kemudian protein-protein pengawal T- DNA terlepas dan DNA akhirnya terintegrasi ke dalam genom inang. Interaksi antara Agrobacterium dan sel inang target didahului dengan mekanisme secara kimiawi di mana sel inang yang luka menghasilkan suatu metabolit yang berperan sebagai isyarat bagi Agrobacterium. Metabolit tersebut dapat berupa senyawa gula, asam, asam amino atau senyawa fenol Winans 1992. Adanya senyawa tersebut menginduksi Agrobacterium untuk bergerak aktif menuju ke sel sasaran. Gerakan yang bersifat kemotaksis dan untuk memperkuat kontak tersebut Agrobacterium mengeluarkan suatu metabolit y aitu -1-2-glukan. Beberapa gen dalam kromosom Agrobacterium diketahui merupakan penyandi enzim yang berperan dalam sintesis berbagai senyawa glukan, yaitu chvA, chvB, dan exoC. Gen lain pada kromosom yang berperan seperti ketiga gen tersebut adalah cel, produk cel berperan penting dalam sintesis senyawa selulosa fibril Douglas et al. 1985; Gelvin 2000. Induksi faktor virulensi vir yang akan mengatur proses pemotongan dan transfer T-DNA ke sel inang target. Beberapa metabolit yang disekresi oleh inang, akan menginduksi faktor virulensi. Metabolit tersebut adalah asetosiringon, hidroksi asetosiringon, koniferil alkohol dan etil piruvat Winans 1992. Aktivasi gen vir dimulai dengan penerimaan sinyal oleh VirA. VirA merupakan protein sensor trans-membran yang berfungsi mendeteksi molekul sinyal berupa senyawa fenolik seperti asetosiringon. Selain itu, beberapa jenis monosakarida juga berfungsi sebagai sinyal. Deteksi monosakarida dimungkinkan oleh adanya interaksi dan asosiasi antara protein VirA dengan ChvE yang berfungsi sebagai protein pengikat gula glukosagalaktosa pada periplasma de la Riva et al. 1998. Protein dari VirA ini akan menginduksi VirG melalui fosforilasi, yang selanjutnya VirG akan mengaktifkan ekspresi berbagai Vir lainnya Winans 1992. Induksi protein-protein Vir dikontrol oleh dua komponen sistem yaitu VirAG Rosen Ron 2011. Protein yang dihasilkan oleh gen Vir berperan untuk memotong dan mentransfer T-DNA ke inang. Proses perpindahan T-DNA ke sel tanaman diawali dengan pemotongan utas T-DNA dari plasmid Ti. Protein VirD1 dan VirD2 yang memiliki aktivitas endonuklease akan mengenali sekuen batas T-DNA dan memotong utas DNA pada posisi tersebut dan melepaskan utas tunggal T-DNA. Setelah pemotongan, protein VirD2 tetap terikat seca ra kovalen pada ujung 5’ utas T-DNA batas kanan. Asosiasi VirD2 melindungi T-DNA dari aktivitas eksonuklease pada ujung 5’ T-DNA dan juga berfungsi membedakan ujung 5’ T- DNA batas kanan sebagai ujung yang akan ditransfer terlebih dahulu ke sel tanaman. Sintesis utas T-DNA dimulai dari batas kanan T-DNA dan berlangsung dalam arah 5’ ke γ’. Kompleks utas tunggal T-DNA-VirD2 diselubungi oleh VirE2. Asosiasi protein ini mencegah serangan nuklease dan berfungsi membentangkan utas kompleks T-DNA sehingga bentuknya menjadi lebih ramping dan mudah melintasi kanal membran de la Riva et al. 1998. Transpor kompleks T-DNA dan protein Vir lainnya VirE2 dan VirF, dari Agrobacterium menuju ke sel inang melalui sistem sekresi tipe IV. Sistem sekresi tipe IV adalah kanal penghubung Agrobacterium-inang yang tersusun atas protein VirD4 dan 11 jenis protein VirB Tzfira Citovsky 2002; Judd et al. 2005. Protein-protein VirB membentuk kanal membran dan juga berfungsi sebagai ATPase yang menyediakan energi untuk pembentukan kanal maupun proses ekspor T-DNA. VirD4 berperan menunjang interaksi kompleks T-DNA-VirD2 dengan komponen sekresi VirB Gelvin 2000. VirD2 pada kompleks T-DNA akan mengarahkan pergerakan kompleks menuju ke protein VirD4 pada kanal sekresi dan akhirnya menuju ke sitoplasma sel inang. Gambar 5 Ilustrasi mekanisme transformasi genetik menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens Tzfira Citovsky 2002 Kompleks T-DNA ditargetkan menuju ke nukleus melintasi membran inti. Sinyal lokasi inti atau nuclear location signals NLS yang terdapat pada protein VirD2 dan VirE2 mengarahkan kompleks menuju ke inti sel. Protein VirF juga diduga berperan dalam penargetan T-DNA ke nukleus de la Riva et al. 1998. Penghantaran kompleks T-DNA menuju nukleus dibantu oleh perangkat transpor intraseluler yang dimiliki oleh sel inang. Dynein dan mikrotubula pada sel tanaman target diduga memfasilitasi transpor T-DNA melintasi sitoplasma. Kompleks T-DNA masuk ke dalam inti sel melalui kompleks pori nukleus atau nuclear-pore complex NPC Tzfira Citovsky 2006. Proses masuknya T-DNA ke dalam inti sel melibatkan kerja sama antara faktor-faktor inang seperti karyopherin α KAPα dan protein interaksi VirEβ 1 atau VirE2-interacting protein1 VIP1; dengan faktor-faktor asal bakteri seperti VirD2, VirE2 dan VirE3 Tzfira et al. 2002. Integrasi T-DNA ke dalam genom inang merupakan tahap paling menentukan dalam transformasi genetik. Mekanisme molekuler yang mendasari integrasi T-DNA masih belum jelas. Integrasi T-DNA diduga terjadi melalui rekombinasi yang difasilitasi oleh perangkat perbaikan DNA sel inang. Utas tunggal T-DNA diubah menjadi molekul intermediat berutas ganda. Molekul intermediat tersebut akan dikenali sebagai fragmen DNA yang putus, dan kemudian akan digabungkan kembali ke dalam genom inang Tzfira Citovsky 2006.