9 Metode DPPH merupakan salah satu metode aktivitas antioksidan yang
sederhana dengan menggunakan 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil DPPH sebagai senyawa pendeteksi Miller et al., 2000. DPPH 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazil adalah senyawa radikal bebas yang stabil yang dapat bereaksi
dengan atom hidrogen yang berasal dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi Simanjuntak et al., 2004. Reaksi antara DPPH dengan senyawa
antioksidan dapat dilihat pada Gambar 5. Pengukuran kapasitas antioksidan
dengan metode DPPH menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 517 nm Kubo et al., 2002. Penurunan absorbansi menunjukkan
adanya aktivitas scavenging aktivitas antioksidan.
•
N-NC
6
H
5 2
•
NH-NC
6
H
5 2
O
2
N NO
2
O
2
N NO
2
+ AH + A
•
NO
2
NO
2
Gambar 5. Reaksi peredaman radikal bebas DPPH oleh antioksidan
Metode aktivitas kemampuan mereduksi digunakan untuk menentukan antioksidan total pada sampel Kardono dan Dewi, 1998. Aktivitas
antioksidan diukur sebagai kemampuan mereduksi Kalium Ferri Sianida. Pengukuran aktivitas kemampuan mereduksi diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 700 nm. Absorbansi yang tinggi menunjukkan kemampuan mereduksi yang tinggi Yang et al., 2000.
D. EKSTRAKSI
Ekstraksi adalah proses pemisahan komponen-komponen terlarut dari komponen yang tidak larut dari suatu campuran dengan pelarut yang sesuai
Leniger dan Beverloo, 1975. Proses ekstraksi dipengaruhi oleh lama ekstraksi, suhu dan jenis pelarut yang digunakan. Semakin lama waktu yang
digunakan dan semakin tinggi suhu yang digunakan, semakin sempurna proses ekstraksi. Semakin dekat tingkat kepolaran pelarut dengan komponen
yang akan diekstrak, semakin sempurna proses ekstraksi. Untuk menemukan senyawa pengekstrak yang baik diperlukan bahan pengekstrak yang memiliki
10 kepolaran yang sama dengan zat yang diekstrak. Jika komponen yang
diekstrak belum diketahui tingkat kepolarannya, biasanya digunakan beberapa pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda.
Sebelum memulai ekstraksi, dilakukan persiapan bahan baku yang mencakup pengeringan bahan sampai kadar air tertentu dan penggilingan
bahan untuk mempermudah proses ekstraksi Purseglove et al., 1981. Selain itu, tingkat kemudahan ekstraksi bahan kering masih ditentukan oleh ukuran
partikel bahan. Bahan yang akan diekstrak sebaiknya berukuran seragam untuk mempermudah kontak antar bahan dengan pelarut Purseglove et al.,
1981. Metode ekstraksi yang dilakukan tergantung pada beberapa faktor antara
lain tujuan ekstraksi, skala ekstraksi, sifat komponen yang akan diekstrak, dan sifat pelarut yang akan digunakan Hougton dan Raman, 1998. Beberapa
metode umum ekstraksi yang biasa dilakukan adalah ekstraksi dengan pelarut, distilasi, Supercritical Fluid Extraction SFE, pengepresan mekanik, dan
sublimasi. Diantara metode-metode tersebut, metode yang banyak dilakukan adalah distilasi dan ekstraksi menggunakan pelarut Hougton dan Raman,
1998. Prinsip ekstraksi menggunakan pelarut adalah bahan yang akan diekstrak kontak langsung dengan pelarut selama selang waktu tertentu dan
komponen yang akan diekstrak akan terlarut dalam pelarut.
E. FITOKIMIA
Senyawa-senyawa yang dihasilkan dari sintesis tanaman kebanyakan merupakan senyawa aktif yang memiliki fungsi fisiologis bagi tubuh Lin,
1994. Senyawa tersebut dinamakan senyawa fitokimia. Senyawa fitokimia potensial mencegah berbagai penyakit seperti penyakit degeneratif dan
kardiovaskuler Lin, 1994. Menurut Bidlack dan Wang 2000, beberapa senyawa fitokimia dapat mencegah kanker. Senyawa yang termasuk senyawa
fitokimia antara lain senyawa fenol, flavonoid, tanin, alkaloid, steroid dan triterpenoid Harborne, 1987. Menurut Meskin et al. 2002, asam fitat dan
saponin termasuk senyawa fitokimia nonfenol yang banyak terdapat pada kacang-kacangan.
11
1. Fenol
Senyawa fenol meliputi berbagai senyawa yang berasal dari tumbuhan yang memiliki ciri yang sama yaitu cincin aromatik yang
mengandung satu atau dua gugus hidroksil Harborne, 1987 Gambar 6. Senyawa fenol diantaranya adalah senyawa fenol sederhana seperti
monofenol dengan satu cincin benzen 3-etilfenol, 3,4-dimetilfenol yang banyak ditemukan pada kacang-kacangan, grup asam hidroksi sinamat
asam ferulat dan kafeat, flavonoid dan glikosidanya katekin, proantosianin, antosianidin, dan flavonol dan tanin yang merupakan
senyawa fenol yang kompleks dengan berat molekul yang tinggi Johnson, 2001. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya
berikatan dengan gula sebagai glikosida Harborne, 1987. OH
Gambar 6. Struktur kimia komponen fenolik
Senyawa fenol pada kacang-kacangan terdiri dari senyawa fenol sederhana dan kompleks. Kacang-kacangan mengandung campuran
beberapa senyawa fenol yang dapat berfungsi sinergis dengan komponen lain dan berfungsi sebagai antioksidan dan pencegahan berbagai penyakit
Meskin et al., 2002. Menurut Mukhopadhiay 2000, polifenol memiliki kemampuan untuk berikatan dengan metobolit lain seperti protein, lemak
dan karbohidrat membentuk senyawa kompleks yang stabil sehingga menghambat mutagenesis dan karsinogenesis. Polifenol memiliki sifat
antioksidatif dan antitumor Mukhopadhiay, 2000. Menurut Bidlack dan Wang 2000, polifenol dapat digunakan sebagai pencegah penyakit
kardiovaskuler dan kanker. Shahidi dan Wanasundara 1992 di dalam Bidlack dan Wang
2000 menyatakan bahwa senyawa fenol terbukti sebagai sumber antioksidan yang efektif, penangkap radikal bebas dan pengkelat ion-ion
logam. Aktivitas antioksidan dari senyawa fenol berhubungan dengan struktur senyawa fenol Meskin et al., 2002. Keberadaan grup hidroksil
12 atau metoksi pada posisi orto atau para dari turunan asam benzoat,
penilpropanoid atau flavonoid isoflavon diketahui dapat meningkatkan aktivitas antioksidan dari senyawa fenol Meskin et al., 2002. Sementara
keberadaan dua grup hidroksil pada posisi orto atau para dapat menghasilkan struktur quinoid yang stabil, dan grup metoksi pada posisi
orto atau para adalah elektron donor yang efektif dalam menstabilkan radikal bebas yang terbentuk, sehingga meningkatkan aktivitas dari
senyawa fenol. Penilpropanoid merupakan antioksidan yang lebih efektif dibandingkan dengan senyawa fenol lainnya.
2. Flavonoid
Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol Harborne, 1987. Jenis utama flavonoid yang terdapat dalam tanaman
antara lain dihidrokalkon, kalkon, flavan, katekin flavan-3-ol, leukoantosianidin flavan-3,4-diol, flavanon, flavanonol dihidroflavonol,
flavon, flavonol, garam flavilium, antosianidin dan auron. Berdasarkan struktur, flavonoid dapat diklasifikasikan menjadi flavonoid 1,3-
diarilpropan, isoflavonoid 1,2-diarilpropan dan neoflavonoid 1,1- diarilpropan. Senyawa-senyawa isoflavonoid dan neoflavonoid hanya
ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan, terutama suku leguminosa kacang-kacangan. Pada kacang kedelai, semua flavonoid yang ditemukan
adalah isoflavon Pratt dan Hudson, 1990. Flavonoid sangat efektif digunakan sebagai antioksidan Johnson,
2001. Senyawa flavonoid dapat mencegah penyakit kardiovaskuler dengan menurunkan oksidasi Low Density Protein LDL Johnson, 2001.
Senyawa isoflavon genistein dan daidzein pada kacang kedelai bermanfaat dalam mencegah oksidasi dari partikel lipid dan menurunkan
resiko terjadinya aterosklerosis Anderson et al., 1999. Choi et al. 1991 menyatakan bahwa flavonoid dapat menurunkan hiperlipidemia pada
manusia. Pada kasus penyakit jantung, penghambatan oksidasi LDL dapat mencegah pembentukan sel-sel busa dan mencegah perkembangan
kerusakan lipid Meskin et al., 2002.
13
3. Tanin
Tanin merupakan salah satu senyawa fenol kompleks yang terdapat pada kacang-kacangan Meskin et al., 2002. Tanin terkondensasi
dihasilkan melalui polimerisasi flavonoid dan banyak terdapat pada tanaman kayu yaitu pada lapisan biji. Tanin dapat bersifat sebagai
antioksidan karena kemampuannya dalam menstabilkan fraksi lipid dan keaktifannya dalam penghambatan lipoksigenase Zeuthen dan Sørensen,
2003. 4. Alkaloid
Senyawa alkaloid umumnya mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen sebagai bagian dari sistem
siklik Harborne, 1987. Berdasarkan cincin heterosiklik nitrogen, alkaloid dapat diklasifikasikan antara lain pirolidin, piperidin, isokuinolin, indol,
kuinolin. Senyawa alkaloid memiliki aktifitas fisiologis sehingga banyak
digunakan dalam bidang pengobatan. Kuinin, morfin dan striknin adalah contoh alkaloid yang memiliki pengaruh fisiologis dan psikologis. Alkaloid
pirolizidin diketahui memiliki aktivitas antikanker Mukhopadhyay, 2000.
5. Triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon
C
30
asiklik, yaitu skualena Harborne, 1987. Senyawa ini berstruktur siklik yang nisbi rumit, kebanyakan berupa alkohol, aldehida atau asam
karboksilat. Senyawa triterpenoid yang terdapat pada tumbuhan tingkat tinggi adalah fitosterol yang terdiri dari sitosterol
β-sitosterol, stigmasterol dan kampesterol. Pada kacang-kacangan seperti kacang kedelai terdapat
senyawa triterpenoid yaitu sitosterol dan stigmasterol Goldberg, 2003. Senyawa terpenoid dapat digunakan untuk pengobatan dan terapi
Goldberg, 2003.
14
6. Steroid
Steroid merupakan golongan dari senyawa triterpenoid Harborne, 1987. Senyawa steroid dapat diklasifikasikan menjadi steroid dengan atom
karbon tidak lebih dari 21 steroid sederhana dan steroid dengan atom karbon lebih dari 21 seperti sterol, sapogenin, alkaloid steroid, glikosida
jantung dan vitamin D Hogiono dan Dangi, 1994. Menurut Hogiono dan Dangi 1994, steroid alami berasal dari berbagai transformasi kimia dua
triterpen yaitu lanosterol dan sikloartenol. Pada umumnya, steroid tumbuhan berasal dari sikloartenol. Senyawa steroid dapat digunakan
sebagai bahan dasar untuk pembuatan obat Hogiono dan Dangi, 1994. 7. Saponin
Saponin merupakan senyawa aktif permukaan yang dihasilkan dari grup steroid atau triterpen yang berikatan dengan gula Meskin et al.,
2002. Saponin bersifat seperti sabun dan dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa Harborne, 1987. Senyawa saponin dapat
ditemukan pada kacang-kacangan seperti pada kacang kedelai Meskin et al
., 2002. Senyawa ini memiliki pengaruh biologis yang menguntungkan yaitu bersifat sebagai hipokolesterolemik dan antikarsinogen serta dapat
meningkatkan sistem imun Rao dan Koratkar, 1997 di dalam Meskin et al., 2002.
F. ASAM FITAT
Asam fitat adalah suatu mio-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 heksakis dihidrogen fosfat, dan merupakan sumber utama unsur fosfor dalam kacang-kacangan
Koswara, 1992. Menurut Salunke et al. 1985, pada kacang-kacangan 60-80 fosfor terdapat dalam bentuk asam fitat. Asam fitat yang terdapat pada
oilseeds adalah sekitar 1-6 Harland dan Obertas, 1977 di dalam Meskin et
al ., 2002. Kandungan fitat terdapat dalam biji kedelai sebesar 1.4 Meskin
et al ., 2002. Koswara 1992 menyatakan kandungan fitat dalam biji kedelai
terdistribusi merata dalam semua bagian biji.
15 Asam fitat dapat membentuk kompleks dengan protein dan pati
sehingga disebut sebagai senyawa antinutrisi Meskin et al., 2002. Asam fitat juga dapat mengikat senyawa-senyawa mineral seperti seng, kalsium,
magnesium dan besi Koswara, 1992. Asam fitat dapat mengkelat ion logam ion besi penyebab oksidasi. Karena kemampuannya dalam mengkelat ion
besi, asam fitat berpotensi menghambat pembentukan radikal hidroksil yang disebabkan oleh ion besi Meskin et al., 2002. Rickard dan Thompson 1997
di dalam Meskin et al. 2002 menyatakan bahwa asam fitat bersifat sebagai antikanker di dalam usus besar dan di dalam kelenjer susu pada hewan
percobaan, serta memiliki sifat hipokolesterolemik. Selain itu, asam fitat juga berpotensi dalam mencegah penyakit kardiovaskuler Meskin et al., 2002.
16
III. METODOLOGI PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT
Bahan baku yang digunakan adalah kacang komak. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis kimia adalah etil asetat, kloroform, metanol, HCl,
NaOH 2N, etanol 95 , air bebas ion, aquades, reagen Folin-Ciocalteau 50 vv, Na
2
CO
3
5 bv, asam tanat, buffer fosfat 0.2M, pH 6.60, K
3
FeCN
6
1 , larutan trikhloroasetat TCA 10 , larutan FeCl
3
, buffer asetat 100 mM pH 5.50, DPPH 3 mM, asam askorbat, K
2
SO
4
, HgO, H
2
SO
4
, H
3
BO
3
, indikator merah metil dan metilen blue, NaOH-Na
2
S
2
O
3
, H
2
SO
4
2N, iodin, kalium iodida, HgCl
2
, asam asetat glasial, Pb-asetat jenuh, etanol 70 , HNO
3
0.5M, Amonium tiosianat, Ca-fitat 0.2 mM dan amil alkohol. Peralatan yang digunakan untuk pembuatan tepung kacang komak
adalah oven, wileymill dan ayakan. Peralatan untuk ekstraksi diantaranya adalah shaker, magnetic stirrer,
penyaring vakum, dan rotavapor. Peralatan untuk analisis adalah tabung reaksi, sudip,
pipet tetes, pipet mohr, vorteks, spektrofotometer, labu takar, inkubator, sentrifuse, pHmeter, water bath, gelas
piala, pHmeter, termometer, labu Kjeldahl, alat destilasi lengkap, buret,
erlenmeyer, aluminium foil, mikropipet, tips, neraca kasar dan neraca analitik.
B. METODOLOGI PENELITIAN a.
Penyediaan Sampel 1. Pembuatan Tepung Kacang Komak
Kacang komak disortir dahulu, kemudian dicuci sampai bersih sebelum direndam dalam larutan alkali NaOH 2N selama tiga jam untuk
mengurangi aktivitas tripsin inhibitor dan tanin, serta menghilangkan aktivitas hemaglutinin. Kacang yang telah direndam lalu ditiriskan dan
dicuci dengan air untuk menghilangkan sisa larutan alkali. Pengeringan dilakukan dengan oven pada suhu 50ºC sampai kering. Hasil pengeringan
kemudian digiling dengan wileymill. Tepung kacang diayak dengan saringan ukuran 60 mesh. Tepung kacang hasil ayakan disimpan dalam
tempat tertutup, sebelum digunakan pada tahap selanjutnya.