20 destilat dalam erlenmeyer. Destilat yang tertampung kemudian dititrasi
dengan HCl 0.02N sampai terjadi perubahan warna. Hal yang sama dilakukan terhadap blanko. Perhitungan kadar protein adalah sebagai
berikut:
N = ml HCl-ml blanko x N HCl x 14.007 x100 mg sampel
protein = N x faktor konversi Faktor konversi = 6.25
3. Analisis Kadar Total Fenol dengan Metode Chandler dan Dodds yang Dimodifikasi Shetty
et al., 1995 di dalam Radianti, 2005
Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang bersih dan ditambahkan 1 ml etanol 95 dan 5 ml air bebas ion.
Selanjutnya ditambahkan pada masing-masing sampel 0.5 ml reagen Folin-Ciocalteu 50 vv lalu diencerkan dengan air bebas ion. Setelah
5 menit, 1 ml Na
2
CO
3
5 wv ditambahkan dan diencerkan kembali dengan air bebas ion jika terlalu pekat. Setelah itu divorteks dan
disimpan pada ruangan gelap selama 60 menit. Sampel dihomogenisasi divorteks kembali, dan absorbansinya diukur pada 725 nm.
Sebagai standar digunakan asam tanat. Pembuatan standar asam tanat yaitu dengan cara membuat larutan induk 200 ppm. Penentuan
kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan total fenol sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva
standar. Seri larutan standar dipersiapkan seperti tabel di bawah ini: Tabel 3. Seri larutan standar asam tanat
Konsentrasi ppm
0 25 50
75 100
125 Larutan induk
ml 0.125 0.25 0.375 0.500 0.625
Etanol 95 ml
1 0.875 0.75 0.625 0.500 0.375
21
4. Analisis Fitokimia Houghton dan Raman, 1998, Dep Kes RI, 2000, di dalam Azima, 2004
a. Fenol hidrokuinon Pereaksi FeCl
3
Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram dilarutkan dalam 1 ml etanol 70 . Ekstrak sampel diambil 0.5 ml kemudian
ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
5 . Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Senyawa
fenol kemungkinan terdapat dalam tanaman dalam bentuk bebas atau dalam bentuk glikosidik.
b. Flavonoid
Ekstrak kacang komak sebanyak 1 mg dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian larutan
ditambahkan beberapa tetes Pb-asetat jenuh. Terbentuknya larutan berwarna merah atau jingga tua menunjukkan reaksi positif. Warna
jingga tua menunjukkan adanya senyawa kalkon dan warna merah menunjukkan adanya senyawa auron.
c. Tanin Pereaksi FeCl
3
Ekstrak kacang komak sebanyak 50 mg ditambahkan air dan dididihkan selama beberapa menit, kemudian ditambahkan beberapa
tetes FeCl
3
1 . Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.
d. Alkaloid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2N. Kemudian diuji dengan pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Meyer
dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan dan endapan coklat
dengan pereaksi Wagner.
22 Pereaksi Wagner, dibuat dengan cara: dipipet 1.25 ml akuades
ditambahkan 0.31 gram iodin dan 0.25 gram kalium iodida. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 25 ml dalam labu
takar. Pereaksi ini berwarna coklat. Pereaksi Meyer, dibuat dengan cara: 0.136 gram HgCl
2
ditambahkan 0.05 gram kalium iodida. Kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 10 ml dalam labu takar. Pereaksi
ini tidak berwarna.
e. Triterpenoid Uji Liebermann-Burchard
Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram ditambahkan 0.2 ml asam asetat glasial, kemudian ditambahkan 3 tetes asam sulfat pekat.
Apabila sampel mengandung terpenoid maka reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna merah dan berubah ke biru.
f. Steroid Uji Liebermann-Burchard
Ekstrak kacang komak sebanyak 0.05 gram dilarutkan dalam 0.5 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering. Kemudian ke dalam
larutan ditambahkan 0.125 ml asam asetat glasial dan 0.038 ml asam sulfat pekat. Terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama
kali, kemudian berubah menjadi biru dan hijau menunjukkan reaksi positif.
g. Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa
yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N, menunjukkan adanya saponin.
5. Analisis Kadar Asam Fitat Davies dan Reid, 1979 di dalam Muchtadi, 1989
Sebanyak 0.4 gram sampel disuspensikan dalam 20 ml larutan HNO
3
0.5 M, diaduk dengan magnetic stirrer selama tiga jam, kemudian
23 disaring untuk mendapatkan filtratnya. Sebanyak 0.5 ml filtrat
dimasukkan ke dalam tabung reaksi kering, ditambahkan 0.9 ml HNO
3
0.5 M dan 1 ml FeCl
3
dalam tabung reaksi bertutup, divorteks dan direndam dalam penangas air mendidih selama 20 menit, lalu
didinginkan. Campuran dipindahkan ke tabung sentrifuse dan ditambahkan 5 ml amil alkohol lalu divorteks. Sebanyak 0.1 ml amonium
tiosianat ditambahkan ke dalam campuran 15 menit sebelum pengukuran absorbansi. Campuran kemudian divorteks dan disentrifuse 1500 rpm
selama 2 menit. Lapisan amil alkohol diukur absorbansinya pada panjang gelombang 465 nm 15 menit setelah penambahan amonium tiosianat.
Sebagai standar digunakan Ca-fitat. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan fitat sampel
berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Seri larutan standar dipersiapkan seperti pada Tabel 4.
Tabel 4. Seri larutan standar Ca-fitat Konsentrasi
mM 0 0.04 0.08 0.12 0.166 0.20
Larutan induk ml
0 1 2 3 4 5 HNO3 0.5 M
ml 5 4 3 2 1 0
6. Aktivitas Antioksidan a. Uji DPPH Kubo
