4.9. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration MIC

masing-masing parameter pada sumbu X. Komposisi medium yang digunakan adalah maltosa 10 g L -1 , glukosa 2 g L -1 , pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 1 g L -1 , Fe.citrate nH 2 O 0,3 g L -1 , pH: 7,6, air demineral 250 mL, air laut 750 mL. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi dilakukan pada suhu 30 °C selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Laju pertumbuhan spesifik maksimum μ maks dan rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y xs juga ditentukan. Laju pertumbuhan spesifik maksimum μ maks diperoleh dari gradien koefisien arah kurva selama fase eksponensial dari ln X biomassa pada sumbu X terhadap waktu jam pada sumbu Y. Rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y xs diperoleh dari gradien yang dibentuk oleh kurva X t –Xo pada sumbu Y versus S o -S pada sumbu X Mangunwidjaya et al. 1994. Pertumbuhan biomassa, perubahan pH, gula pereduksi, nitrogen total, dan konsentrasi siklotirosil-prolil diukur dalam setiap interval waktu 8 jam. Prosedur penentuan konsentrasi gula pereduksi, nitrogen total, dan bobot kering sel berturut-turut disajikan dalam Lampiran 2, 3, dan 4.

III. 4.12. Penentuan Suhu dan pH Awal Terbaik pada Proses Fermentasi

Suhu terbaik proses fermentasi ditentukan dalam rentang 26, 28, 30, 32, dan 34 °C. Inkubasi dilakukan dengan menggunakan shaker inkubator. Komposisi medium fermentasi yang digunakan adalah maltosa 10 g L -1 , glukosa 2 g L -1 , pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 1 g L -1 , Fe.citrate nH 2 O 0,3 g L -1 , air demineral 250 mL, dan air laut 750 mL, serta pH medium ditentukan sebelum proses sterilisasi pada pH 7,6. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi lakukan selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm, dan kriteria suhu terbaik dipilih pada suhu fermentasi yang menghasilkan konsentrasi siklotirosil-prolil paling tinggi. Penetapan pH awal medium fermentasi terbaik ditentukan dalam beberapa titik yaitu pH 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8. Variasi pH awal medium fermentasi diatur sebelum sterilisasi dilakukan. Komposisi medium fermentasi yang digunakan adalah maltosa 10 g L -1 , glukosa 2 g L -1 , pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 1 g L -1 , Fe.citrate nH 2 O 0,3 g L -1 , air demineral 250 mL, dan air laut 750 mL. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi dilakukan selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm, dan kriteria pH terbaik dipilih pH fermentasi yang menghasilkan konsentrasi siklotirosil-prolil paling tinggi. III.4.13. Optimasi Medium Fermentasi Optimasi medium fermentasi diawali dengan percobaan pendahuluan untuk mendapatkan jenis sumber karbon, sumber nitrogen, dan mineral terbaik. Pada penentuan sumber karbon terbaik, komposisi medium utamanya adalah komposisi menurut Kanoh et al. 2005; pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 1 g L -1 , Fe.citrate nH 2 O 0,3 g L -1 , pH: 7,5, air demineral 250 mL, air laut 750 mL yang ditambahkan 10 g L -1 sumber karbon yang akan diuji. Dalam hal ini jenis sumber karbon yang diuji adalah glukosa, maltosa, laktosa, sukrosa, molase, dan dektrin. Penentuan sumber nitrogen terbaik dilakukan dengan komposisi medium adalah 10 g L -1 glukosa, Fe.citrate hydrate 0,3 g L -1 , air demineral 250 mL, air laut 750 mL, sumber nitrogen dengan bobot masing-masing disesuaikan dengan nitrogen total seperti yang disajikan dalam Lampiran 5. Sumber nitrogen yang digunakan antara lain asam glutamat, ekstrak khamir, pepton, amonium sulfat dan hidrolisat kasein. Konsentrasi masing-masing sumber nitrogen mengacu pada Kanoh et al. 2005, yaitu konsentrasi nitrogen ditentukan menjadi 0,76 g L -1 . Penentuan komposisi mineral terbaik dilakukan dengan mengacu dari beberapa sumber literatur yang disajikan dalam Tabel 2. Kompisisi medium fermentasi untuk penentuan mineral terbaik adalah komposisi medium menurut Kanoh et al. 2005 yang dimodifikasi; glukosa 10 g L -1 , pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 1 g L -1 , Fe.citrate hydrate 0,3 g L -1 , pH: 7,5, air demineral 250 mL, air laut 750 mL. Proses fermentasi penentuan sumber karbon, nitrogen, dan mineral terbaik dilakukan selama 144 jam dengan volume kerja 100 mL dalam labu erlenmeyer 250 mL, suhu 30 °C, dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Kriteria yang digunakan untuk menentukan sumber karbon, sumber nitrogen, dan mineral terbaik adalah yang menghasilkan konsentrasi siklotirosil-prolil paling tinggi. Tabel 2 Komposisi mineral yang digunakan dalam medium fermentasi No Mineral Komposisi 1 Komposisi mineral menurut Sousa et al. 2001 K 2 HPO 4 1 g L -1 , MgSO 4. 7 H 2 O 0,025 g L -1 , ZnSO 4 7 H 2 O 0,025 g L -1 , CaCl 2 .2 H 2 O 0,025 g L -1 , FeSO 4 7 H 2 O 0,025 g L -1 . 2 Komposisi mineral menurut Furtado et al. 2005 KH 2 PO 4 0,6 g L -1 , Mg.SO 4 .7 H 2 O 5 g L -1 , Cu.SO 4 .5 H 2 O 0,001 g L -1 , FeSO 4 .7 H 2 O 0,003 g L -1 3 Komposisi mineral menurut Dhananjeyan et al. 2010 K 2 HPO 4 0,1 g L -1 , Mg.SO 4 .7 H 2 O 0,5 g L -1 , CaCl 2 .2H 2 O 0,1 g L -1 , FeSO 4 .5H 2 O 0,05 g L -1 4 Komposisi mineral menurut Voelker Altaba 2001 CaCl 2 .2H 2 O 0,011 g L -1 , FeSO 4 .5H 2 O 0,007 g L -1 , MnCl 2 .4 H 2 O 0,002 g L -1 , ZnSO 4 .7 H 2 O 0,002 g L -1 , CuSO 4 . H 2 O 0,0004 g L -1 , CoCl 2 .6 H 2 O 0,0004 g L -1 5 Komposisi mineral menurut Dharmaraj et al. 2010 NaCl 0,8 g L -1 , NH 4 Cl 1 g L -1 , KCl. 0,1 g L -1 , KH 2 PO 4 0,1 g L -1 , 0,2 g L -1 MgSO 4 . 7H 2 O, 0,04 g L -1 CaCl 2 2H 2 O. Komposisi medium yang digunakan dalam optimasi medium fermentasi menggunakan Response Surface Methodology meliputi 3 variabel terpilih, yaitu sumber karbon, nitrogen, dan mineral, ditambah 2 g L -1 glukosa, air demineral 250 mL, air laut 750 mL. Keasaman medium fermentasi diatur pada pH 7,5 sebelum dilakukan sterilisasi. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi dilakukan selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Ketiga variabel terpilih digunakan sebagai variabel bebas. Sedangkan konsentrasi senyawa aktif yang dihasilkan akibat dari perlakuan 3 variabel bebas tersebut merupakan respon yang akan dicari dalam penelitian ini. Rancangan percobaan untuk mendapatkan data respon yang muncul akibat dari perlakuan digunakan metode Central Composite