Perlakuan Sampel untuk Isolasi Aktinomisetes

IV.2. Isolasi Aktinomisetes

Hasil isolasi aktinomisetes laut yang diambil dari tiga lokasi diperoleh 5 isolat dari pantai utara Cirebon, 29 isolat dari Pantai Anyer Banten, dan 6 isolat dari Pantai Kukup Gunung Kidul Yogyakarta. Jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi setiap bobot sampel sedimen laut relatif lebih sedikit dibandingkan dengan isolasi aktinomisetes dari tanah. Namun demikian potensi untuk mendapatkan mikroba unggul dari aktinomisetes laut lebih besar karena kondisi lingkungan laut yang lebih bervariasi dibandingkan di tanah. Menurut Goodfellow 1983 bahwa walaupun jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi dari laut cenderung lebih sedikit dibandingkan dari tanah namun demikian karakteristik aktinomisetes laut lebih bervariasi dan lebih berpotensi. Pada komposisi medium isolasi dan sejumlah antibiotik yang ditambahkan sama, maka apabila dilihat dari kedua proses pra-perlakuan yaitu dengan menggunakan panas heatshock treatment dan menggunakan pengasaman acid treatment maka terlihat bahwa pra-perlakuan dengan pemanasan lebih efektif dibandingkan pra-perlakuan dengan pengasaman. Praperlakuan pemanasan terbukti mampu menekan pertumbuhan bakteri kontaminan yang biasanya akan tumbuh pada awal inkubasi. Sebaliknya pra-perlakuan asam terbukti masih banyak bakteri kontaminan yang tumbuh dan menyebabkan sulitnya proses pemurnian koloni aktinomisetes. Menurut Hoskisson et al. 2000 perlakuan pemanasan sampel pada 60 °C mampu meningkatkan 5 kali jumlah spora Micromonospora echinospora yang dikulturkan dibandingkan tanpa pemanasan. Disamping mampu menekan bakteri kontaminan perlakuan pemanasan terbukti mampu meningkatkan aktivasi proses respirasi spora dan memacu penggunaan senyawa yang digunakan. Apabila pemanasan dinaikkan menjadi 70 °C, maka waktu yang dibutuhkan untuk proses aktivasi menjadi lebih pendek, namun terjadi pengurangan jumlah spora yang dikulturkan. Pemanasan sampel pada suhu 50 °C selama 30 menit tidak berpengaruh tarhadap pertumbuhan spora yang dikulturkan dibandingkan kontrol. Hal yang sama disampaikan oleh Karwowski 1986 bahwa pemanasan pada suhu 70 °C dalam waktu lebih dari 30 menit berpotensi mengurangi jumlah spora yang dapat dikulturkan pada medium isolasi. Hal yang sama dilakukan oleh Seong et al. 2001. Pemanasan suspensi sampel pada 70 °C dalam waktu lebih dari 30 menit dengan kombinasi penambahan Nistatin 50 μg mL -1 dan asam nalidiksat 20 μg mL -1 mampu menekan pertumbuhan mikroba kontaminan seperti khamir dan fungi. Apabila dilihat dari jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi setiap lokasi pengambilan sampel, terlihat bahwa sampel dari Pantai Anyer Banten menunjukkan jumlah aktinomisetes terbanyak dibanding dengan sampel dari pantai Selatan Yogyakarta dan pantai Utara Cirebon. Perbedaan jumlah isolat yang diperoleh dalam setiap lokasi pengambilan sampel terlihat sangat besar. Salah satu penyebab sedikitnya isolat aktinomisetes yang mampu diisolasi dari Pantai Selatan Yogyakarta dan Pantai Utara Cirebon diduga adalah rentang waktu yang cukup lama antara pengambilan sampel dengan proses penyebaran sampel dalam medium agar medium isolasi. Hal ini menyebabkan bakteri kontaminan tumbuh secara cepat dan bertambah banyak, sehingga mempersulit proses isolasi. Sebagian besar sampel dari pantai Utara Cirebon dan Pantai Selatan Yogyakarta menunjukkan pertumbuhan bakteri kontaminan yang cepat dan menutup seluruh permukaan medium isolasi dalam satu minggu inkubasi yang menyebabkan sulit tumbuhnya aktinomisetes.

IV.3. Penapisan Aktinomisetes Penghasil Antimikroba

Penapisan aktinomisetes dilakukan untuk menentukan dan memilih isolat- isolat yang memiliki aktivitas antimikroba. Penapisan aktinomisetes dilakukan dengan menggunakan uji hambatan terhadap beberapa mikroba uji dengan metode difusi agar. Mikroba uji yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 yang termasuk bakteri Gram- negatif, Staphylococcus aureus ATCC25923 dan Bacillus subtilis ATCC 66923 yang termasuk bakteri Gram-positif, Aspergillus niger BIOMCC00134 yang termasuk dalam golongan fungi, dan Candida albicans BIOMCC00122 yang termasuk dalam golongan khamir. Dari 40 isolat yang telah diisolasi diperoleh 4 isolat yang mampu menghambat Escherichia coli ATCC 25922, 5 isolat mampu menghambat Staphylococcus aureus ATCC25923, 4 isolat mampu menghambat Bacillus subtilis ATCC 66923, 4 isolat mampu menghambat Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, 5 isolat mampu menghambat Candida albicans BIOMCC00122, dan 4 isolat mampu menghambat Aspergillus niger BIOMCC00134. Hasil penapisan aktinomisetes selengkapnya disajikan dalam Tabel 6. Hasil penapisan memperlihatkan bahwa isolat A11 isolat dari Pantai Barat Banten memiliki daya anti bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif yang kuat. Isolat PCL11, A64, dan YK21 memiliki aktivitas antifungi dan tidak memiliki aktivitas terhadap bakteri. Isolat A64 menunjukkan hambatan yang paling kuat terhadap Aspergillus niger BIOMCC00134, dan isolat A44 menunjukkan hambatan paling kuat terhadap Candida albicans BIOMCC00122. Studi lebih lanjut dipilih isolat A11 yang menunjukkan aktivitas antibakteri paling kuat. Selanjutnya dilakukan identifikasi morfologi dan filogenik terhadap isolat A11. Dilihat dari morfologinya, isolat A11 terlihat memiliki hifa yang bercabang dengan arah horisontal maupun vertikal dan terdapat beberapa kantong spora pada ujung hifa seperti yang disajikan dalam Gambar 6a. Dengan mata telanjang, morfologi A11 terlihat warna putih terang, dengan permukaan yang berlipat-lipat, hifa yang panjang membentuk miselium dan terbentuk beberapa hifa antena aerial hyphae yang timbul secara vertikal Gambar 6b, serta miselium substrat yang berwarna putih kecoklatan yang menembus ke dalam medium agar. Adanya aerial hyphae dan miselium substrat yang menembus ke medium agar merupakan salah satu ciri khas Streptomyces. Goodfellow dan William 1988. Pada awal pertumbuhan terbentuk koloni tunggal berbentuk bulat, selanjutnya akan berkembang hifa yang memanjang. Koloni tunggal berbentuk bulat yang semakin lama diinkubasi diameter koloni akan semakin melebar. Morfologi isolat Streptomyces sp.A11 disajikan dalam Gambar 6. Tabel 6 Hasil isolasi dan penapisan aktinomisetes penghasil antimikroba. Daya hambatan terhadap bakterifungi diameter zona bening dalam mm No Kode isolat Jenis perlakuan sampel Lokasi isolasi E.coli S.aureus B.subtilis P.aeruginosa C.albicans A.niger 1 PCL11 HS PUC 7 2 PCL12 HS PUC 3 PCL13 HS PUC 7 7 7 7 4 PCL14 HS PUC 5 PCL15 HS PUC 6 A61 HS PA 7 A62 HS PA 8 A63 HS PA 9 A64 HS PA 15 10 A65 HS PA 11 A66 HS PA 12 A67 A PA 13 A68 A PA 14 A69 A PA 15 A610 A PA 12 16 A611 A PA 17 A11 HS PA 14 15 14 14 18 A12 HS PA 19 A21 HS PA 7 9 20 A23 A PA 21 A24 A PA 22 A31 HS PA 23 A32 HS PA 12 7 24 A33 HS PA 25 A41 HS PA 26 A42 HS PA 27 A43 A PA 10,16 8,67 9,51 28 A44 A PA 10,61 29 A45 A PA 30 A51 HS PA 31 A52 HS PA 32 A53 HS PA 33 A54 HS PA 8,56 8,67 34 A56 A PA 35 YK11 HS PSY 36 YK12 HS PSY 37 YK21 HS PSY 14 38 YK41 HS PSY 9,71 8,71 9,53 9,01 39 YK42 A PSY 40 YK43 A PSY 8,58 Keterangan : PUC : Pantai utara Cirebon PA : Pantai Anyer PSY : Pantai Selatan Yogyakarta HS : Heat shock treatment perlakuan dengan pemanasan pada suhu 60 °C selama 4 jam A : Acid treatment perlakuan sampel dengan pengasaman pada pH 2 selama 2 jam