III. 4.7. HPLC Preparatif
HPLC preparatif dilakukan untuk memurnikan fraksi aktif hasil fraksinasi dari kromatografi kolom pada tahap pemurnian sebelumnya. Purifikasi
menggunakan HPLC preparatif dilakukan dengan menggunakan Waters 2695 HPLC, dengan detektor Photo Diode Array PDA, dan jenis kolom puresil 5
μ C18 4,6x150 mm. Volume injeksi sebesar 100 uL per injeksi dibawah kondisi
tekanan 1267 psi, dan kecepatan alir 1 mL menit
-1
dengan fasa geraknya adalah 0-45 campuran metanol–air dan selama 25 menit Kazakevich dan Lobrutto
2007.
III. 4.8. HPLC Analitik
Pada HPLC analitik digunakan kolom analitik Sunfire C18 column 4,6 x 250 mm, Shiseido Co. Ltd., Tokyo, Japan. Fasa gerak yang digunakan adalah
campuran metanol-air 0-100 dengan elusi linier gradien selama 25 menit dan selanjutnya elusi isokratik 100 metanol selama 10 menit, dengan kecepatan alir
1 mL menit
-1
, volume injeksi 10 μL, dan diamati pada panjang gelombang λ 210
nm Kazakevich dan Lobrutto 2007. Kurva standar senyawa aktif dibuat yang selanjutnya digunakan untuk menentukan konsentrasi senyawa aktif yang akan
ditentukan konsentrasinya. Kurva standar senyawa aktif siklotirosil-prolil disajikan dalam Lampiran 1.
III. 4.9. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration MIC
Minimum Inhibitory Concentration MIC ditentukan dengan cara
melarutkan senyawa antibiotik hasil purifikasi dalam beberapa konsentrasi, yaitu dari konsentrasi 6500
μg mL
-1
, 3250 μg mL
-1
,
1625
μg mL
-1
, 812,5
μg mL
-1
, 406,3
μg mL
-1
, 203,1
μg mL
-1
, 101,6
μg mL
-1
,
dan
50,5
μg mL
-1
. Masing-masing konsentrasi diuji aktivitasnya menggunakan metode disc diffusion agar. MIC
ditentukan terhadap 4 macam bakteri uji yaitu Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus
ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 66923,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Diameter kertas cakram yang digunakan
adalah 6 mm. Zona bening yang terbentuk diukur diameternya. Selanjutnya dibuat kurva Log
[C] konsentrasi sebagai sumbu Y terhadap X
2
diameter zona bening sebagai sumbu X. Titik potong sumbu Y pada X=0 merupakan nilai Log
MIC. Metode penentuan MIC ini mengikuti Bonev et al. 2008 dan Andrews 2001.
III.4.10. Penentuan Kurva Pertumbuhan Mikroba pada Fase Vegetatif
Kurva pertumbuhan ditentukan dengan melakukan pengamatan perubahan biomassa, pH medium,dan gula pereduksi per satuan waktu jam. Sebanyak 2
Ose isolat terpilih diinokulasikan dalam 15 mL medium ekstrak khamir–ekstrak malt pada pH 7,6. Jumlah sel dihitung dan ditentukan, sehingga jumlah sel
menjadi kurang lebih 10
6
-10
8
sel mL
-1
. Sebanyak 3 vv kultur pre-vegetatif diinokulasikan kedalam 100 mL medium vegetatif dalam labu erlenmeyer 250
mL. Komposisi medium vegetatif yang digunakan meliputi; pepton 5 g L
-1
, ekstrak khamir 3 g L
-1
, ekstrak malt 3 g L
-1
, glukosa 10 g L
-1
, air demineral 250 mL, and air laut 750 mL. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 °C selama 64 jam
dengan kecepatan agitasi sebesar 150 rpm. Pengamatan dilakukan setiap 8 jam sekali dengan mencatat perubahan parameter yang diamati. Kurva pertumbuhan
diperoleh dengan melakukan plot perubahan biomassa bobot kering sel, pH, dan gula reduksi sebagai sumbu Y serta waktu pengamatan masing-masing parameter
pada sumbu X. Waktu transfer fase vegetatif ke fase fermentatif ditentukan pada saat sebelum berakhirnya fase logaritmik.
III.4.11. Profil Fermentasi Isolat Streptomyces sp. A11
Profil fermentasi dilakukan dengan mengamati perubahan beberapa parameter seperti pH, biomassa, gula pereduksi, nitrogen total, dan antibiotik yang
dihasilkan selama proses fermentasi. Perubahan parameter tersebut digambarkan dalam bentuk kurva dengan parameter pH, biomassa, gula pereduksi, nitrogen
total, dan antibiotik diplotkan dalam sumbu Y dan interval waktu pengamatan
masing-masing parameter pada sumbu X. Komposisi medium yang digunakan adalah maltosa 10 g L
-1
, glukosa 2 g L
-1
, pepton 5 g L
-1
, ekstrak khamir 1 g L
-1
, Fe.citrate nH
2
O 0,3 g L
-1
, pH: 7,6, air demineral 250 mL, air laut 750 mL. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan
volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi dilakukan pada suhu 30 °C selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Laju pertumbuhan spesifik maksimum
μ
maks
dan rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y
xs
juga ditentukan. Laju pertumbuhan spesifik maksimum
μ
maks
diperoleh dari gradien koefisien arah kurva selama fase eksponensial dari ln X biomassa pada sumbu
X terhadap waktu jam pada sumbu Y. Rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y
xs
diperoleh dari gradien yang dibentuk oleh kurva X
t
–Xo pada sumbu Y versus S
o
-S pada sumbu X Mangunwidjaya et al. 1994. Pertumbuhan biomassa, perubahan pH, gula pereduksi, nitrogen total, dan konsentrasi
siklotirosil-prolil diukur dalam setiap interval waktu 8 jam. Prosedur penentuan konsentrasi gula pereduksi, nitrogen total, dan bobot kering sel berturut-turut
disajikan dalam Lampiran 2, 3, dan 4.
III. 4.12. Penentuan Suhu dan pH Awal Terbaik pada Proses Fermentasi
Suhu terbaik proses fermentasi ditentukan dalam rentang 26, 28, 30, 32, dan 34 °C. Inkubasi dilakukan dengan menggunakan shaker inkubator. Komposisi
medium fermentasi yang digunakan adalah maltosa 10 g L
-1
, glukosa 2 g L
-1
, pepton 5 g L
-1
, ekstrak khamir 1 g L
-1
, Fe.citrate nH
2
O 0,3 g L
-1
, air demineral 250 mL, dan air laut 750 mL, serta pH medium ditentukan sebelum proses
sterilisasi pada pH 7,6. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi lakukan
selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm, dan kriteria suhu terbaik dipilih pada suhu fermentasi yang menghasilkan konsentrasi siklotirosil-prolil
paling tinggi. Penetapan pH awal medium fermentasi terbaik ditentukan dalam beberapa
titik yaitu pH 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 dan 8. Variasi pH awal medium fermentasi diatur sebelum sterilisasi dilakukan. Komposisi medium fermentasi
Kategori