Pertumbuhan Mikrobial Isolation, purification, identification, and fermentation medium optimization of antibiotic produced by marine actinomycetes

antara ln X versus waktu. Ini adalah periode pertumbuhan seimbang atau kondisi mantap dengan laju pertumbuhan spesifik konstan. Sel mikroba membelah dengan cepat dan konstan sehingga jumlah pertumbuhan selnya mengikuti kurva logaritmik. Pada saat laju pertumbuhan atau reproduksi selular mencapai titik maksimum, maka terjadi pertumbuhan secara logaritmik atau eksponensial. Pada fasa ini keadaan pertumbuhan adalah mantap. Dengan laju pertumbuhan spesifik, μ tetap, komposisi selular tetap, sedangkan komposisi kimiawi medium biakan berubah akibat terjadinya sintesis produk dan penggunaan substrat. Pada fase eksponensial, laju pertumbuhan, dxdt meningkat berbanding lurus dengan X. Laju pertumbuhan spesifik tetap dan mencapai nilai maksimal. Laju pertumbuhan dapat digambarkan dengan persamaan sebagai berikut Stanbury dan Whitaker, 1984; dXdt = μ m X..........................................1 Dari persamaan 1 apabila dilakukan integrasi akan diperoleh persamaan sebagai berikut; ln X 1 = lnX o + μ t ..............................2 dari persamaan 2 maka laju pertumbuhan spesifik μ merupakan kemiringan kurva hasil pengaluran plotting ln X 1 konsentrasi biomassa terhadap waktu t. Pertumbuhan berbanding lurus dengan kerapatan selular mikroba, r x = dxdt = μ m X …………………..…..3 pada fasa ini : logX 2 – log X 1 = μ m t2-t1 ….……...…4 maka X 2 = X 1 e μm t2-t1 ……………………..5 apabila pada saat T g adalah X 2 = 2X 1 maka T g =ln2 μ m = 0,69 μ m …………………..6 Tg = waktu penggandaan waktu yang diperlukan untuk mendapatkan konsentrasi biomassa X menjadi dua kali konsentrasi awal Xo pada fasa eksponensial. Pada beberapa titik laju pertumbuhan mulai menurun karena nutrisi dasar telah menjadi berkurang dan hambatan oleh adanya produk metabolik yang terakumulasi. Sel-sel tersebut selanjutnya akan mengalami transisi, sehingga laju pertumbuhan menjadi nol dan memasuki ke fase stasioner. Fase stasioner akan terjadi setelah semua sel berhenti membelah diri atau bila sel hidup dan sel mati mencapai keseimbangan, yaitu dengan laju kematian. Namun meskipun pertumbuhan telah berhenti, mungkin saja masih dapat berlangsung proses metabolisme dan akumulasi produk dalam sel atau dalam kaldu fermentasi. Pada awal fase stasioner, konsentrasi konsentrasi biomassa mengalami maksimal. Fasa penurunan ditandai dengan berkurangnya jumlah sel hidup dalam medium akibat kematian yang diikuti autolisis sel oleh enzim selular. Beberapa kemungkinan yang terjadi apabila inkubasi tetap dilakukan, pertama massa sel total mungkin konstan, kedua masa sel hidup cenderung menurun, ketiga terjadi lisis sel dan masa sel menurun drastis atau sel hidup meningkat kembali oleh pertumuhan kriptik. Pola pertumbuhan sel selama fase lag, fase log, dan fase stasioner disajikan dalam Gambar 2. Fase lag Fase eksponensial Fase stasioner waktu Ko nse n tr asi bi omassa a b c Keterangan : a.massa sel tanpa terjadi lisis b.massa sel terjadi lisis, diikuti pertumbuhan kriptik c.jumlah sel hidup dengan terjadi lisis Gambar 2 Pola pertumbuhan sel selama fase lag, fase log, dan fase stasioner Wang 1979 Berdasarkan kajian pertumbuhan mikroba, dapat ditentukan parameter pertumbuhan seperti koefisien konversi atau rendemen produktivitas. Y xs = X f - X o ……………………………..7 S o - S Keterangan: So : konsentrasi awal substrat S : konsentrasi substrat tersisa yang umumnya mendekati nol dan dapat diabaikan dibandingkan nilai S o apabila jauh lebih besar. Nilai Y xs dinyatakan dalam bobot sel kering per bobot atau mol substrat yang dikonsumsi rendemen molekuler. Produktivitas bobot biomassa yang dihasilkan per volume medium per jam merupakan kriteria untuk mengevaluasi proses fermentasi. Produktivitas maksimal dicapai pada waktu t m dan konsentrasi X m, sehingga; P m = X m t m ………..…….……8 Bila produktivitas total dinyatakan sebagai berikut; P t = X t t t ………………………9 Hubungan laju pertumbuhan mikroba μ dengan konsentrasi substrat S telah digambarkan oleh Monod berdasarkan analogi model kinetik enzimatik Michaelis Menten. Persamaan matematik hubungan laju pertumbuhan dengan konsentrasi substrat adalah sebagai berikut; ………………...………10 μ = μ m S Ks + S Ks merupakan konstanta penggunaan substrat yang menunjukkan afinitas mikroba terhadap substrat. Ks merupakan konsentrasi substrat pada saat μ = μ m 2. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju pertumbuhan spesifik digambarkan pada Gambar 3. Berdasarkan model Monod, laju pertumbuhan r x dapat dinyatakan sebagai berikut; ………….11 r x = μ X = μ m S X Ks + S a c b Substrat g L -1 μ jam -1 Keterangan : a. Pembatasan oleh substrat b.Tidak ada pengaruh oleh substrat c. Penghambatan oleh substrat berlebih Gambar 3 Pengaruh konsentrasi substrat S terhadap laju pertumbuhan spesifik Wang et al.1979. Pada kinetika pertumbuhan mikroba dalam kondisi keseimbangan kimiawi, pertumbuhan sel, pembentukan produk berkaitan erat dengan penggunaan hara atau substrat. Pada fermentasi curah, laju penggunaan substrat persatuan volume, secara sederhana berbanding lurus dengan laju pertumbuhan. rs = 1Y xs rx karena rx = μX maka rs = μX Y xs µ = dxdt. 1x Y xs adalah rendemen biomassa yang terbentuk persatuan substrat yang dikonsumsi. Bila pertumbuhan mikroba mengikuti model Monod, maka laju penggunaan substrat rs dapat dinyatakan sebagai berikut; …..………12 rs = 1Y xs μ m S X Ks + S Hubungan kinetik pertumbuhan dan pembentukan produk tergantung pada peranan produk di dalam metabolisme sel. Ada tiga pola kinetika yang umum dalam hubungannya pada kinetika pertumbuhan dengan pembentukan produk, yaitu: pola pembentukan produk berasosiasi dengan pertumbuhan, pola pembentukan produk tidak berasosiasi dengan pertumbuhan, dan pola campuran antara pembentukan produk berasosiasi dan tak berasosiasi dengan pertumbuhan. Produk yang terbentuk dengan pola pertumbuhan yang berasosiasi dengan pembentukan produk merupakan hasil langsung suatu lintasan katabolik atau disebut metabolit primer. Pada pola ini laju pembentukan produk berbanding secara proporsional dengan laju pertumbuhan; dpdt = α dxdt atau rp = Y px r x dan rp = dpdt dengan Y px adalah rendemen produk yang dihasilkan per biomassa yang dihasilkan gg. Pada berbagai fermentasi, terutama yang menghasilkan metabolit sekunder seperti antibiotik, pembentukan produk tidak berasosiasi dengan pertumbuhan, pembentukan produk biasanya terjadi pada akhir fase pertumbuhan. Laju pembentukan produk berbanding secara proporsional dengan konsentrasi selular dan tidak pada laju pertumbuhan, sehingga ; rp = β x Pada pola campuran antara pembentukan produk dan pertumbuhan, laju pembentukan produk berbanding terbalik dengan konsentrasi sel maupun laju pertumbuhan yang dinyatakan sebagai berikut; dpdt = α dxdt + β x atau 1x dpdt = α 1x dxdt + β atau rpx = α μ + β …….13 p = Konsentrasi produk x = Konsentrasi biomassa t = Waktu µ = Laju pertumbuhan spesifik α = Tetapan yang menunjukkan bagian produk yang diproduksi pada fase logaritmik. β = Tetapan yang menunjukkan bagian produk yang diproduksi pada fase logaritmik. Model ini disebut model kinetika Leudeking dan Piret Mangunwidjaja dan Suryani 1994.

II.6. Identifikasi Mikroba Menggunakan 16S rRNA

Identifikasi mikroba menggunakan metode molekuler dengan mendeteksi elemen genom DNA dan RNA merupakan salah satu teknik identifikasi yang akurat. Identifikasi secara molekuler banyak digunakan untuk mempertegas hasil identifikasi secara fenotip seperti identifikasi morfologi, maupun identifikasi secara biokimia. Identifikasi molekuler memiliki keunggulan lebih akurat, pengerjaannya lebih cepat, dan dapat digunakan untuk identifikasi mikroba yang tidak dapat dikulturkan unculture. Prinsip dasar identifikasi secara molekuler adalah mendeteksi secara spesifik sekuen nukleotida pada genom mikroba, dan dihibridisasi menggunakan sekuen label komplementer berdasarkan pendeteksian Iwen dan Peter, 2004. Identifikasi berdasarkan sekuen memerlukan pengenalan target molekuler untuk memberikan perbedaan banyaknya varietas mikroba. Beberapa area target genom yang sudah dikenal yaitu bagian gen 16S rRNA. Daerah 16S rRNA merupakan daerah terkonservasi pada mikroba prokariot dan memberikan ciri spesifik dari tiap mikroba prokariot. Sehingga daerah 16S rRNA digunakan untuk mengklarifikasi makhluk hidup ke dalam kelompok yaitu archaea, bakteri, dan prokarya. Ribosomal RNA rRNA merupakan salah satu jenis molekul RNA yang unik disamping duta RNA mRNA dan transfer RNA tRNA. RNA berperan dalam pembentukan kerangka ribosom yang merupakan organel penting dalam proses translasi RNA menjadi asam amino Gick dan Pasternack 2003. Saat ini RNA telah banyak dijadikan sebagai sumber analisis filogenik dan pengklasifikasian makluk hidup. Hal ini disebabkan molekul rRNA bersifat homologi baik secara fungsional maupun evolusinya pada organisme yang berbeda Broun-Howland et al. 1992. Tahapan dasar untuk identifikasi molekuler dengan menggunakan analisis sekuen adalah sebagai berikut; 1. Isolasi DNA atau RNA. Deoxyribonucleic acid atau disingkat DNA merupakan bahan penyusun gen, yaitu penurun sifat yang meneruskan informasi dari induknya Campbell et al. 2002. DNA terdapat di dalam inti sel terutama pada kromosom. Molekul DNA juga ditemukan pada organel-organel sel seperti sel pada mitokondria dan kloroplas. Ada beberapa tahapan dalam melakukan isolasi DNA, pertama isolasi jaringan, pelisisan dinding sel ekstraksi DNA, dan presipitasi. Presipitasi dilakukan untuk mengendapkan protein sehingga terpisah dari ikatan DNA. 2. PCR Polymerase Chain Reaction. Reaksi polimerasi berantai atau lebih dikenal dengan PCR merupakan suatu metode amplifikasi fragmen DNA secara cepat dan dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar. Secara prinsip PCR merupakan proses berulang, setiap siklusnya dibagi menjadi 3 tahapan, yaitu pertama tahap denaturasi yaitu DNA terputus dan membentuk DNA rantai tunggal, kedua tahap penempelan annealing, yaitu primer menempel pada bagian DNA template yang berkomplementer urutan basanya, ketiga tahap amplifikasi, yaitu tahap penggandaan. Setelah tahap ketiga selesai, maka akan terjadi lagi secara berulang secara terus menerus. Tahapan ini terus berulang 20 sampai dengan 30 kali Yuwono dan Triwibowo 2006.