4. Tahapan Penelitian Response Surface Methodology

III.4.1. Pra-perlakuan Sampel dan Isolasi Aktinomisetes Metode isolasi yang digunakan mengacu pada metode yang dilakukan oleh Mincer et al. 2005 yang dimodifikasi. Namun demikian sebelum dilakukan proses isolasi aktinomisetes, terlebih dahulu dilakukan percobaan pendahuluan untuk menentukan metode pra-perlakuan sampel yang paling tepat, yang meliputi 1 tanpa pra-perlakuan kontrol, 2 pra-perlakuan dengan metode heat shock yang dilakukan dengan memanaskan sampel selama 4 jam pada suhu 60 °C Pisano et al. 1986, 3 pengasaman sampel yang dilakukan dengan cara mengasamkan sampel sampai dengan pH 2 menggunakan asam klorida, dan didiamkan selama 2 jam, selanjutnya dinetralkan kembali menggunakan NaOH. 4 Pemanasan sampel metode ke-2 yang dikombinasikan dengan penambahan 100 μg mL -1 sikloheksimid dan 25 μg mL -1 nistatin, 5 Pengasaman sampel metode ke-3 yang dikombinasikan dengan penambahan 100 μg mL -1 sikloheksimid dan 25 μg mL -1 nistatin, 6 Metode ke-4 yang dikombinasikan dengan penambahan 20 μg mL -1 asam nalidiksat dan 5 μg mL -1 rifampisin. 7 Metode ke-5 yang dikombinasikan dengan penambahan 20 μg mL -1 asam nalidiksat dan 5 μg mL -1 rifampisin. 8 Metode ke-4 yang dikombinasikan dengan penambahan 40 μg mL -1 asam nalidiksat dan 10 μg mL -1 rifampisin 9. Metode ke-5 yang dikombinasikan dengan penambahan 40 μg mL -1 asam nalidiksat dan 10 μg mL -1 rifampisin. Antibiotik ditambahkan setelah medium agar disterilisasi. Komposisi medium isolasi adalah sebagai berikut; 10 g soluble starch , 2 g pepton, 4 g ekstrak khamir, 16 g agar dalam 1000 mL air laut. Sampel yang digunakan untuk percobaan pendahuluan adalah sampel dari Pantai Anyer Banten. Setelah diperoleh metode pra-perlakuan sampel yang paling tepat, selanjutnya digunakan untuk proses isolasi aktinomisetes pada tahap selanjutnya. Pengambilan sampel diambil dari tiga lokasi pantai, antara lain dari pantai utara Cirebon, Desa Gebang koordinat 6°4837S 108°4527E, Pantai Anyer Banten koordinat 6°319S 105°5429E dan Pantai Kukup Gunung Kidul Yogyakarta koordinat 8°83S 110°3319E dengan kedalaman rata-rata 0,5 sampai dengan 1 m. Sebanyak 5 g masing-masing sedimen sampel disimpan dalam falcon tube 14 mL dan diletakkan dalam dryice box selama pengambilan sampel di lapangan. Selanjutnya sedimen sampel dicuci dengan menggunakan air demineral steril dan dilakukan pra-perlakuan dengan menggunakan metode yang telah dipilih dalam percobaan pendahuluan. Cairan sampel yang telah mengalami pra-perlakuan selanjutnya diencerkan secara seri dari 10 -1 sampai dengan 10 -5 . Sebanyak 0,1 mL sampel yang telah diencerkan, disebarkan pada permukaan agar medium isolasi. Komposisi medium agar untuk isolasi adalah sebagai berikut; 10 g soluble starch, 2 g pepton, 4 g ekstrak khamir, 16 g agar dalam 1000 mL air laut Pisano et al. 1989. Medium isolasi yang telah diinokulasikan diinkubasi di dalam inkubator dengan suhu 30 °C selama kurang lebih 25 hari. Koloni tunggal dipilih dan dimurnikan kembali dengan melakukan pemindahan koloni ke dalam medium baru yaitu dengan medium marine agar sampai diperoleh koloni tunggal. Masing-masing koloni diberi kode sesuai dengan asal lokasi sampling. Kode A digunakan untuk sampel dari Pantai Anyer Banten, kode YK berasal dari pantai Kukup Yogyakarta, Kode PCl berasal dari pantai utara Cirebon Desa Gebang. Isolat yang telah dimurnikan dari hasil isolasi disebarkan kembali dalam medium marine agar untuk proses peremajaan sebelum digunakan untuk proses fermentasi. Sebagian isolat murni yang telah diremajakan dipindahkan dalam gliserol 15 dan disimpan dalam suhu -40 °C untuk proses preservasi. Kultur stok yang akan digunakan diremajakan lagi sebelum digunakan untuk fermentasi. III.4.2. Kultur Vegetatif dan Fermentatif pada Proses Penapisan dan Penggandaan Skala untuk Preparasi Ekstrak Fermentasi. Sejumlah koloni yang telah dimurnikan dikulturkan vegetatif dengan menggunakan medium ekstrak khamir-ekstrak malt YEME. Inkubasi kultur vegetatif dilakukan selama 48 jam pada suhu 30 °C dengan komposisi medium: pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 3 g L -1 , ekstrak malt 3 g L -1 , glukosa 10 g L -1 , air demineral 250 mL, and air laut 750 mL. Sebelum sterilisasi, pH medium diatur pada 7,6 dengan menggunakan NaOH 0,1 N dan HCl 0,1 N. Sepuluh persen vv medium vegetatif diinokulasikan ke dalam medium fermentatif. Komposisi medium fermentatif adalah sebagai berikut; pepton 5 g L -1 , ekstrak khamir 1 g L - 1 , Fe III citrate hydrate 0,3 g L -1 , air demineral 250 mL, dan air laut 750 mL Kanoh et al. 2005 . Sebelum sterilisasi, pH medium diatur pada 7,6. Fermentasi dilakukan pada suhu 30 ºC selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 200 rpm menggunakan incubator shaker. Volume kerja kultur vegetatif dan fermentatif pada tahap penapisan dilakukan pada volume 3 mL dalam BD falcon around bottom volume 14 mL. Preparasi ekstrak kaldu fermentasi untuk uji aktivitas aktinomisetes bioassay pada tahap penapisan, dilakukan dengan cara mengeringkan 3 mL kaldu fermentasi dengan metode kering beku, selanjutnya ditambahkan 3 mL metanol dan divorteks selama 15 menit. Biomassa dan supernatan dipisahkan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 14000 x g selama 15 menit. Pada tahap penggandaan volume fermentasi untuk preparasi kaldu fermentasi, medium vegetatif dan fermentatif adalah sama dengan medium vegetatif dan fermentatif proses penapisan, namun volume kerja kultur vegetatif dilakukan pada volume masing-masing 100 mL dalam labu erlenmeyer 250 mL sebanyak 5 labu erlenmeyer dan fermentasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 30 °C dengan kecepatan agitasi sebesar 150 rpm. Sedangkan tahap fermentatif volume kerja masing-masing 1 l dalam labu erlenmeyer 2 l sebanyak 5 labu erlenmeyer. Sebelum sterilisasi pH medium diatur pada 7,6. Fermentasi dilakukan pada suhu 30 ºC selama 144 jam dengan kecepatan agitasi sebesar 150 rpm. III.4.3. Uji Aktivitas Antimikroba Bioassay Penapisan aktinomisetes penghasil antimikroba dan uji aktivitas antimikroba bioassay dilakukan dengan metode difusi agar dengan menggunakan kertas cakram diameter 6 mm. Mikroba uji yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Bacillus subtilis ATCC 66923, Candida albicans BIOMCC00122 and Aspergillus niger BIOMCC00134. Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, dan Bacillus subtilis ATCC 66923 ditumbuhkan pada medium nutrient agar dan Candida albicans BIOMCC00122 dan Aspergillus niger BIOMCC00134. ditumbuhkan pada Potato Dextrose Agar. Sebanyak 15 μL ekstrak sampel diteteskan dalam kertas cakram, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Selanjutnya diletakkan pada permukaan agar yang telah diinokulasikan 15 μL 10 6 sel mL -1 mikroba uji per cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 °C selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk diukur diameter zonanya Prescott et al. 2002

III. 4.4. Analisis Sekuen Gen 16S rRNA

Isolat murni hasil preservasi dalam gliserol stok diremajakan kembali dan dilakukan identifikasi. Identifikasi didasarkan pada analisis 16S rRNA. DNA diisolasi dengan menggunakan FastPrep, kit khusus untuk isolasi DNA. Sampel dilisis menggunakan lysing matrix kit dan dihomogenasi menggunakan FastPrep selama 40 detik pada 4500 rpm. Amplifikasi DNA dikerjakan menggunakan PCR dengan primers 8 F dan 1492R. PCR yang mengandung primer 8F dan 1492R ditambahkan ke dalam larutan DNA, selanjutnya dipurifikasi menggunakan kit ekstraksi GelDNA. Gen 16S rRNA yang diperoleh selanjutnya dilakukan sekuen DNA menggunakan Dye ® terminator V 3.1 cycle sequencing kit. Peralatan DNA sekuen yang digunakan adalah ABI 300 genetic analyzer. Selanjutnya sekuen yang diperoleh dibandingkan dengan database yang tersedia dalam NCBI menggunaan BLAST search engine http:blast.ncbi.nlm.nih.govBlast.cgi. Pohon filogenik dibuat menggunakan program ClustalW Mega 3.1 dengan membandingkan beberapa DNA sekuen dari spesies aktinomisetes yang diperoleh dari database gen di NCBI. Analisis digunakan metode neighbor-joining dengan bootstrap dataset 100 kali pengulangan yang telah tersedia dalam program Mega 3.1. III.4.5. Pemisahan dan Pemurnian Senyawa Aktif Kaldu Fermentasi Proses pemisahan dan pemurnian dilakukan dengan mengikuti metode Shindo et al. 1995 yang dimodifikasi. Kaldu fermentasi yang mengandung campuran sisa medium, biomassa, dan senyawa aktif dipisahkan padatannya dengan sentrifugasi pada kecepatan 14000 x g selama 15 menit. Fase padat biomassa dipisahkan dari cairannya dan dilakukan pemecahan sel dengan sonikator. Padatan sel diekstraksi menggunakan metanol dua kali. Fasa cair supernatan diekstraksi menggunakan etil asetat dengan perbandingan volume yang sama, dan ekstraksi dilakukan sebanyak 2 kali. Ekstrak supernatan dan biomassa dipekatkan dengan rotavapor sampai diperoleh ekstrak pekat. Ekstrak yang sudah dipekatkan selanjutnya difraksinasi menggunakan kromatografi kolom φ25 x 500 mm, dengan fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 0,063-0,200mm dan fasa gerak yang digunakan campuran metanol- kloroform, dengan elusi gradien bertahap dari kloroform:metanol 100:0 berubah dengan berkurangnya 10 kloroform, sampai diperoleh elusi kloroform:metanol 0:100. Sebanyak 30 fraksi dikumpulkan dan diuji bioassay aktivitas antimikrobanya. Fraksi aktif dimurnikan kembali menggunakan HPLC preparatif. Semua fraksi hasil pemurnian dengan HPLC preparatif dikumpulkan dan diuji bioassay aktivitas antimikrobanya. Fraksi aktif murni dikumpulkan dan ditentukan bobot dan struktur molekulnya. III.4.6. Identifikasi Struktur Kimia Senyawa Aktif Gugus fungsional senyawa aktif diidentifikasi menggunakan FTIR Infra Red Spectrofotometry FTIR Shimadzu 8300, bobot molekul senyawa aktif ditentukan dengan LCMS Liquid Chromatography Mass Spetrofotometry LCT Premier-XE Waters, hubungan tata letak atom karbon dan proton dideteksi dengan 13 C NMR, DEPT, dan 1 HNMR Bruker AV-500 500 MHz. Titik leleh melting point ditentukan dengan menggunakan Gallen Kamp Melting Point Bicasa.

III. 4.7. HPLC Preparatif

HPLC preparatif dilakukan untuk memurnikan fraksi aktif hasil fraksinasi dari kromatografi kolom pada tahap pemurnian sebelumnya. Purifikasi menggunakan HPLC preparatif dilakukan dengan menggunakan Waters 2695 HPLC, dengan detektor Photo Diode Array PDA, dan jenis kolom puresil 5 μ C18 4,6x150 mm. Volume injeksi sebesar 100 uL per injeksi dibawah kondisi tekanan 1267 psi, dan kecepatan alir 1 mL menit -1 dengan fasa geraknya adalah 0-45 campuran metanol–air dan selama 25 menit Kazakevich dan Lobrutto 2007.

III. 4.8. HPLC Analitik

Pada HPLC analitik digunakan kolom analitik Sunfire C18 column 4,6 x 250 mm, Shiseido Co. Ltd., Tokyo, Japan. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran metanol-air 0-100 dengan elusi linier gradien selama 25 menit dan selanjutnya elusi isokratik 100 metanol selama 10 menit, dengan kecepatan alir 1 mL menit -1 , volume injeksi 10 μL, dan diamati pada panjang gelombang λ 210 nm Kazakevich dan Lobrutto 2007. Kurva standar senyawa aktif dibuat yang selanjutnya digunakan untuk menentukan konsentrasi senyawa aktif yang akan ditentukan konsentrasinya. Kurva standar senyawa aktif siklotirosil-prolil disajikan dalam Lampiran 1.

III. 4.9. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration MIC

Minimum Inhibitory Concentration MIC ditentukan dengan cara melarutkan senyawa antibiotik hasil purifikasi dalam beberapa konsentrasi, yaitu dari konsentrasi 6500 μg mL -1 , 3250 μg mL -1 , 1625 μg mL -1 , 812,5 μg mL -1 , 406,3 μg mL -1 , 203,1 μg mL -1 , 101,6 μg mL -1 , dan 50,5 μg mL -1 . Masing-masing konsentrasi diuji aktivitasnya menggunakan metode disc diffusion agar. MIC ditentukan terhadap 4 macam bakteri uji yaitu Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 66923,