4. Tahapan Penelitian Response Surface Methodology
III.4.1. Pra-perlakuan Sampel dan Isolasi Aktinomisetes
Metode isolasi yang digunakan mengacu pada metode yang dilakukan oleh Mincer et al. 2005 yang dimodifikasi. Namun demikian sebelum dilakukan
proses isolasi aktinomisetes, terlebih dahulu dilakukan percobaan pendahuluan untuk menentukan metode pra-perlakuan sampel yang paling tepat, yang meliputi
1 tanpa pra-perlakuan kontrol, 2 pra-perlakuan dengan metode heat shock yang dilakukan dengan memanaskan sampel selama 4 jam pada suhu 60 °C
Pisano et al. 1986, 3 pengasaman sampel yang dilakukan dengan cara mengasamkan sampel sampai dengan pH 2 menggunakan asam klorida, dan
didiamkan selama 2 jam, selanjutnya dinetralkan kembali menggunakan NaOH. 4 Pemanasan sampel metode ke-2 yang dikombinasikan dengan penambahan
100 μg mL
-1
sikloheksimid dan 25 μg mL
-1
nistatin, 5 Pengasaman sampel metode ke-3 yang dikombinasikan dengan penambahan 100
μg mL
-1
sikloheksimid dan 25 μg mL
-1
nistatin, 6 Metode ke-4 yang dikombinasikan dengan penambahan 20
μg mL
-1
asam nalidiksat dan 5 μg mL
-1
rifampisin. 7 Metode ke-5 yang dikombinasikan dengan penambahan 20
μg mL
-1
asam nalidiksat dan 5
μg mL
-1
rifampisin. 8 Metode ke-4 yang dikombinasikan dengan penambahan 40
μg mL
-1
asam nalidiksat dan 10 μg mL
-1
rifampisin 9. Metode ke-5 yang dikombinasikan dengan penambahan 40
μg mL
-1
asam nalidiksat dan 10
μg mL
-1
rifampisin. Antibiotik ditambahkan setelah medium agar disterilisasi. Komposisi medium isolasi adalah sebagai berikut; 10 g soluble
starch , 2 g pepton, 4 g ekstrak khamir, 16 g agar dalam 1000 mL air laut. Sampel
yang digunakan untuk percobaan pendahuluan adalah sampel dari Pantai Anyer Banten. Setelah diperoleh metode pra-perlakuan sampel yang paling tepat,
selanjutnya digunakan untuk proses isolasi aktinomisetes pada tahap selanjutnya. Pengambilan sampel diambil dari tiga lokasi pantai, antara lain dari pantai
utara Cirebon, Desa Gebang koordinat 6°4837S 108°4527E, Pantai Anyer Banten koordinat 6°319S 105°5429E dan Pantai Kukup Gunung Kidul
Yogyakarta koordinat 8°83S 110°3319E dengan kedalaman rata-rata 0,5 sampai dengan 1 m. Sebanyak 5 g masing-masing sedimen sampel disimpan
dalam falcon tube 14 mL dan diletakkan dalam dryice box selama pengambilan
sampel di lapangan. Selanjutnya sedimen sampel dicuci dengan menggunakan air demineral steril dan dilakukan pra-perlakuan dengan menggunakan metode yang
telah dipilih dalam percobaan pendahuluan. Cairan sampel yang telah mengalami pra-perlakuan selanjutnya diencerkan secara seri dari 10
-1
sampai dengan 10
-5
. Sebanyak 0,1 mL sampel yang telah diencerkan, disebarkan pada permukaan agar
medium isolasi. Komposisi medium agar untuk isolasi adalah sebagai berikut; 10 g soluble starch, 2 g pepton, 4 g ekstrak khamir, 16 g agar dalam 1000 mL air laut
Pisano et al. 1989. Medium isolasi yang telah diinokulasikan diinkubasi di dalam inkubator
dengan suhu 30 °C selama kurang lebih 25 hari. Koloni tunggal dipilih dan dimurnikan kembali dengan melakukan pemindahan koloni ke dalam medium
baru yaitu dengan medium marine agar sampai diperoleh koloni tunggal. Masing-masing koloni diberi kode sesuai dengan asal lokasi sampling. Kode A
digunakan untuk sampel dari Pantai Anyer Banten, kode YK berasal dari pantai Kukup Yogyakarta, Kode PCl berasal dari pantai utara Cirebon Desa Gebang.
Isolat yang telah dimurnikan dari hasil isolasi disebarkan kembali dalam medium marine agar untuk proses peremajaan sebelum digunakan untuk proses
fermentasi. Sebagian isolat murni yang telah diremajakan dipindahkan dalam gliserol 15 dan disimpan dalam suhu -40 °C untuk proses preservasi. Kultur
stok yang akan digunakan diremajakan lagi sebelum digunakan untuk fermentasi.
III.4.2. Kultur Vegetatif dan Fermentatif pada Proses Penapisan dan Penggandaan Skala untuk Preparasi Ekstrak Fermentasi.
Sejumlah koloni yang telah dimurnikan dikulturkan vegetatif dengan menggunakan medium ekstrak khamir-ekstrak malt YEME. Inkubasi kultur
vegetatif dilakukan selama 48 jam pada suhu 30 °C dengan komposisi medium: pepton 5 g L
-1
, ekstrak khamir 3 g L
-1
, ekstrak malt 3 g L
-1
, glukosa 10 g L
-1
, air demineral 250 mL, and air laut 750 mL. Sebelum sterilisasi,
pH medium diatur pada 7,6 dengan menggunakan NaOH 0,1 N dan HCl 0,1 N. Sepuluh persen vv
medium vegetatif diinokulasikan ke dalam medium fermentatif. Komposisi medium fermentatif adalah sebagai berikut;
pepton 5 g L
-1
, ekstrak khamir 1 g L
-
1
, Fe III citrate hydrate 0,3 g L
-1
, air demineral 250 mL, dan air laut 750 mL Kanoh et al.
2005 .
Sebelum sterilisasi, pH medium diatur pada 7,6. Fermentasi
dilakukan pada suhu 30 ºC selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 200 rpm menggunakan incubator shaker. Volume kerja kultur vegetatif dan fermentatif
pada tahap penapisan dilakukan pada volume 3 mL dalam BD falcon around bottom
volume 14 mL. Preparasi ekstrak kaldu fermentasi untuk uji aktivitas aktinomisetes
bioassay pada tahap penapisan, dilakukan dengan cara mengeringkan 3 mL kaldu fermentasi dengan metode kering beku, selanjutnya ditambahkan 3 mL
metanol dan divorteks selama 15 menit. Biomassa dan supernatan dipisahkan menggunakan sentrifugasi
pada kecepatan 14000 x g selama 15 menit. Pada tahap penggandaan volume fermentasi untuk preparasi kaldu
fermentasi, medium vegetatif dan fermentatif adalah sama dengan medium vegetatif dan fermentatif proses penapisan, namun volume kerja kultur vegetatif
dilakukan pada volume masing-masing 100 mL dalam labu erlenmeyer 250 mL sebanyak 5 labu erlenmeyer dan fermentasi dilakukan selama 48 jam pada suhu
30 °C dengan kecepatan agitasi sebesar 150 rpm. Sedangkan tahap fermentatif
volume kerja masing-masing 1 l dalam labu erlenmeyer 2 l sebanyak 5 labu erlenmeyer.
Sebelum sterilisasi pH medium diatur pada 7,6. Fermentasi dilakukan
pada suhu 30 ºC selama 144 jam dengan kecepatan agitasi sebesar 150 rpm.
III.4.3. Uji Aktivitas Antimikroba Bioassay
Penapisan aktinomisetes penghasil antimikroba dan uji aktivitas antimikroba bioassay dilakukan dengan metode difusi agar dengan menggunakan kertas
cakram diameter 6 mm. Mikroba uji yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa
ATCC27853, Bacillus subtilis ATCC 66923, Candida albicans BIOMCC00122 and Aspergillus niger BIOMCC00134. Escherichia coli ATCC 25922,
Staphylococcus aureus ATCC25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, dan
Bacillus subtilis ATCC 66923 ditumbuhkan pada medium nutrient agar dan
Candida albicans BIOMCC00122 dan Aspergillus niger BIOMCC00134.
ditumbuhkan pada Potato Dextrose Agar. Sebanyak 15
μL ekstrak sampel diteteskan dalam kertas cakram, kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Selanjutnya diletakkan pada
permukaan agar yang telah diinokulasikan 15 μL 10
6
sel mL
-1
mikroba uji per cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 °C selama 24 jam. Zona bening
yang terbentuk diukur diameter zonanya Prescott et al. 2002