yang digunakan untuk menentukan sumber karbon, sumber nitrogen, dan mineral terbaik adalah yang menghasilkan konsentrasi siklotirosil-prolil paling tinggi.
Tabel 2 Komposisi mineral yang digunakan dalam medium fermentasi
No Mineral
Komposisi 1
Komposisi mineral menurut Sousa et al. 2001
K
2
HPO
4
1 g L
-1
, MgSO
4.
7 H
2
O 0,025 g L
-1
, ZnSO
4
7 H
2
O 0,025 g L
-1
, CaCl
2
.2 H
2
O 0,025 g L
-1
, FeSO
4
7 H
2
O 0,025 g L
-1
. 2
Komposisi mineral menurut Furtado et al. 2005
KH
2
PO
4
0,6 g L
-1
, Mg.SO
4
.7 H
2
O 5 g L
-1
, Cu.SO
4
.5 H
2
O 0,001 g L
-1
, FeSO
4
.7 H
2
O 0,003 g L
-1
3 Komposisi mineral menurut
Dhananjeyan et al. 2010 K
2
HPO
4
0,1 g L
-1
, Mg.SO
4
.7 H
2
O 0,5 g L
-1
, CaCl
2
.2H
2
O 0,1 g L
-1
, FeSO
4
.5H
2
O 0,05 g L
-1
4 Komposisi mineral menurut
Voelker Altaba 2001 CaCl
2
.2H
2
O 0,011 g L
-1
, FeSO
4
.5H
2
O 0,007 g L
-1
, MnCl
2
.4 H
2
O 0,002 g L
-1
, ZnSO
4
.7 H
2
O 0,002 g L
-1
, CuSO
4
. H
2
O 0,0004 g L
-1
, CoCl
2
.6 H
2
O 0,0004 g L
-1
5 Komposisi mineral menurut
Dharmaraj et al. 2010 NaCl 0,8 g L
-1
, NH
4
Cl 1 g L
-1
, KCl. 0,1 g L
-1 ,
KH
2
PO
4
0,1 g L
-1 ,
0,2 g L
-1
MgSO
4
. 7H
2
O, 0,04 g L
-1
CaCl
2
2H
2
O. Komposisi medium yang digunakan dalam optimasi medium fermentasi
menggunakan Response Surface Methodology meliputi 3 variabel terpilih, yaitu sumber karbon, nitrogen, dan mineral, ditambah 2 g L
-1
glukosa, air demineral 250 mL, air laut 750 mL. Keasaman medium fermentasi diatur pada pH 7,5
sebelum dilakukan sterilisasi. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan labu erlenmeyer 250 mL dengan volume kerja sebesar 100 mL. Fermentasi dilakukan
selama 144 jam dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Ketiga variabel terpilih digunakan sebagai variabel bebas. Sedangkan konsentrasi senyawa aktif yang
dihasilkan akibat dari perlakuan 3 variabel bebas tersebut merupakan respon yang akan dicari dalam penelitian ini. Rancangan percobaan untuk mendapatkan data
respon yang muncul akibat dari perlakuan digunakan metode Central Composite
Design . Selanjutnya untuk menentukan daerah optimum pada respon digunakan
metode permukaan respon Response Surface Methodology. Untuk membantu penyelesaian optimasi ini akan digunakan perangkat lunak Design Expert 7.
Kisaran dan taraf variabel yang diuji pada optimasi disajikan dalam Tabel 3.
Tabel 3 Kisaran dan taraf variabel yang diuji pada optimasi komposisi medium Kisaran dan taraf
Variabel yang diuji -1,68 -1 0 1 1,68
Konsentrasi sumber karbon g L
-1
21,6 25 30 35 38,4 Konsentrasi sumber nitrogen g L
-1
6,64 8 10 12 13,36 Penambahan mineral mL larutan
stok per liter kaldu fermentasi 3,3 5 7,5 10 11,7
Dalam studi ini digunakan 8 titik faktorial fraksional 2
3-1
, 6 titik bintang, dan 6 titik pusat, sehingga total percobaan adalah 20 percobaan. Nilai pusat
perlakuan yang digunakan adalah konsentrasi sumber karbon 30 g L
-1
, konsentrasi nitrogen 10 g L
-1
, dan konsentrasi mineral adalah 7,5 mL L
-1
. Tabel 4 menunjukkan matrik satuan-satuan percobaan pada optimasi medium fermentasi
dalam kode dan nilai asli. Dengan 3 variabel yang diuji maka model kuadratiknya persamaan sebagai berikut Mongomery 1997.
Y = bo + b
1
X
1i
+ b
2
X
2i
+ b
3
X
3i
+ b
11
X
1i 2
+ b
22
X
2i 2
+ b
33
X
3i 2
+ b
12
X
1i
X
2i
+ b
12
X
1i
X
2i
+ b
13
X
1i
X
3i
+ b
23
X
2i
X
3i
Keterangan : Y = konsentrasi senyawa aktif mg L
-1
X
1
= konsentrasi sumber karbon g L
-1
X
2
= konsentrsi sumber nitrogen g L
-1
X
3
= volume penambahan mineral mL.
Tabel 4 Matrik Central Composite Design yang mengandung 20 percobaan dengan 3 variabel percoban dalam kode unit.
No. X
1
X
2
X
3
Koefisien yang diuji ResponY
1 1 1 1 2 1 -1 -1
3 -1 1 -1 4 1 1 -1
5 1 -1 1 6 -1 1 1
7 -1 -1 1 8 -1 -1 -1
Fraksional 2
3-1
faktorial design
9 -1,68 10 0 -1,68 0
11 0 0 -1,68 12 1,68 0
13 0 1,68 0 Konsentrasi
siklotirosil-prolil mg L
-1
14 0 0 1,68 Titik bintang 6 titik
15 0 0 0 16 0 0 0
17 0 0 0 18 0 0 0
19 0 0 0 20 0 0 0
Titik pusat 6 titik
IV HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1. Perlakuan Sampel untuk Isolasi Aktinomisetes
Sebelum dilakukan isolasi aktinomisetes, terlebih dahulu dilakukan penelitian pendahuluan untuk menentukan metode pra-perlakuan sampel yang
paling tepat. Pra-perlakuan sampel dilakukan untuk mengurangi pertumbuhan mikroba yang tidak dikehendaki mikroba kontaminan, sehingga proses isolasi
aktinomisetes menjadi lebih mudah. Sampel yang digunakan untuk penentuan metode pra-perlakuan ini adalah sampel yang diambil dari Pantai Anyer Banten.
Hasil pra-perlakuan sampel isolasi aktinomisetes disajikan dalam Tabel 5. Pra-perlakuan ke-1 sampai dengan ke-5 menunjukkan mikroba
kontaminan menutup seluruh permukaan medium agar Tabel 5. Hal ini akan menekan pertumbuhan aktinomisetes dan mempersulit proses pengambilan koloni
aktinomisetes. Pra-perlakuan dengan pemanasan dan pengasaman diharapkan dapat menekan pertumbuhan bakteri Gram-negatif yang banyak terdapat di air
laut. Dibandingkan dengan metode 1 sebagai kontrol, metode pemanasan dan pengasaman mampu menekan bakteri kontaminan, terbukti kecepatan
pertumbuhan bakteri kontaminan lebih lambat dibandingkan dengan kontrol metode ke-1. Namun demikian metode pemanasan dan pengasaman belum
efektif untuk digunakan dalam isolasi ini, karena pada hari ke-3 permukaan medium agar masih dipenuhi oleh bakteri kontaminan, koloni aktinomisetes akan
muncul pada hari ke-15 sampai dengan hari ke-21 Hozzein et al. 2008; Dhanasekaran et al. 2009. Seperti halnya metode ke-2 dan ke-3, metode isolasi
dengan penambahan sikoloheksimid dan nistatin pada medium isolasi, belum dapat menekan pertumbuhan bakteri kontaminan secara keseluruhan. Pada hari
ke-3 pertumbuhan bakteri kontaminan masih menutup seluruh permukaan medium agar. Sikloheksimid dan nistatin hanya efektif menghambat pertumbuhan
fungi dan khamir. Dengan demikian mikroba yang mampu tumbuh dan berkembang pada medium yang mengandung sikloheksimid dan nistatin diduga
adalah kelompok bakteri.
Tabel 5 Hasil pra-perlakuan sampel pada proses isolasi aktinomisetes.
Metode ke-
Jenis pra-perlakuan Pengamatan
pertumbuhan mikroba
kontaminan Keterangan
1 Tanpa adanya
pra-perlakuan kontrol
Sangat banyak Inkubasi hari ke-2, seluruh
permukaan medium isolasi dipenuhi mikroba
kontaminan
2 Pemanasan sampel pada 60 °C
selama 4 jam Banyak
Inkubasi hari ke-3, seluruh permukaan medium isolasi
dipenuhi mikroba kontaminan
3 Pengasaman sampel pada pH 2
selama 2 Jam Banyak
Inkubasi hari ke-3, seluruh permukaan medium isolasi
dipenuhi mikroba kontaminan
4 Pemanasan sampel pada 60 °C
selama 4 jam dan penambahan sikloheksimid 100
μg mL
-1
dan nistatin 25
μg mL
-1
Banyak Inkubasi hari ke-3, seluruh
permukaan medium dipenuhi mikroba kontaminan
5 Pengasaman pada pH 2 selama 2
jam dan penambahan sikloheksimid 100
μg mL
-1
dan nistatin 25
μg mL
-1
Banyak Inkubasi hari ke-3, seluruh
permukaan medium dipenuhi mikroba kontaminan
6 Pemanasan pada 60 °C selama 4
jam dan penambahan sikloheksimid 100
μg mL
-1
, nistatin 25
μg mL
-1
, asam nalidiksat 20
μg mL
-1
, rifampisin 5 μg mL
-1
Sedang Pertumbuhan koloni
terpisah dan tidak tertutup oleh
mikroba kontaminan
7 Pengasaman pada pH 2 selama 2
jam dan penambahan sikloheksimid 100
μg mL
-1
, nystatin 25
μg mL
-1
, asam nalidiksat 20
μg mL
-1
, rifampisin 5 μg mL
-1
Sedang Pertumbuhan koloni
terpisah dan tidak tertutup oleh
mikroba kontaminan
8 Pemanasan pada 60 °C selama 4
jam dan penambahan sikloheksimid 100
μg mL
-1
, nistatin 25
μg mL
-1
, asam nalidiksat 40
μg mL
-1
, rifampisin 10
μg mL
-1
Tidak tumbuh Pertumbuhan koloni
aktinomisetes juga tertekan tidak tumbuh
9 Pengasaman pada pH 2 selama 2
jam dan penambahan sikloheksimid 100
μg mL
-1
, nistatin 45
μg mL
-1
, asam nalidiksat 30
μg mL
-1
, rifampisin 10
μg mL
-1
Tidak tumbuh Pertumbuhan koloni
aktinomisetes juga tertekan tidak tumbuh.
Keterangan : Komposisi medium isolasi; soluble starch 10 g, pepton 2 g, ekstrak khamir 4 g, agar 16 g dalam 1000 mL air laut
Selanjutnya penambahan antibiotik rifampisin 5
μg
mL
-1
dan asam nalidiksat 20
μg
mL
-1
terlihat mampu menekan pertumbuhan bakteri Gram-postif dan Gram-negatif. Kombinasi antara pra-perlakuan pemanasan atau pengasaman
dengan penambahan antibiotik sikloheksimid 100
μg
mL
-1
, nistatin 25
μg
mL
-1
, asam nalidiksat 20
μg
mL
-1
, rifampisin 5
μg
mL
-1
mampu menekan pertumbuhan mikroba kontaminan, sehingga pada inkubasi sampai dengan hari ke-21 beberapa
koloni aktinomisetes dapat tumbuh dan tidak tertutup oleh mikroba kontaminan, baik itu fungi maupun bakteri lainnya. Namun demikian beberapa koloni fungi
dan bakteri tetap tumbuh dalam medium agar, dan tidak menutup koloni lainnya. Menurut Seong et al. 2001 pemanasan suspensi sampel pada suhu 70 °C selama
15 menit mampu menurunkan populasi bakteri Gram-negatif dan fungi kontaminan, serta dapat menaikkan rasio koloni aktinomisetes. Penambahan
nistatin 50
μg
mL
-1
dan asam nalidiksat 20
μg
mL
-1
mampu menekan pertumbuhan fungi dalam medium isolasi. Menurut Pisano et al. 1989
rifampicin 2,5
μg
mL
-1
efektif menekan pertumbuhan bakteri Gram-negatif. Namun demikian komposisi dan konsentrasi antibiotik dalam medium isolasi
yang digunakan akan berbeda tergantung dari biodiversitas mikrooganisme di dalam sampel. Pada penelitian ini penggunaan pra-perlakuan kombinasi
pemanasan atau pengasaman sampel yang dikombinasikan dengan sikloheksimid dan nistatin belum sepenuhnya efektif untuk mengurangi sejumlah bakteri
kontaminan. Kombinasi metode pra-perlakuan pemanasan atau pengasaman dengan penambahan sikloheksimid 100
μg
mL
-1
, nistatin 25
μg
mL
-1
, asam nalidiksat 20
μg
mL
-1
, rifampisin 5
μg
mL
-1
dalam medium agar, lebih efektif menghambat mikroba kontaminan dan meningkatkan jumlah koloni
aktinomisetes. Rifampisin diketahui efektif menghambat bakteri Gram-negatif dan Gram-positif, serta mampu menghambat mikobakterium yang banyak terdapat
di daerah perairan. Namun demikian pada penambahan konsentrasi rifampisin dan asam nalidiksat menjadi dua kalinya pra-perlakuan ke-8 dan ke-9 ternyata
berakibat menghambat pertumbuhan koloni aktinomisetes dan mikroba lainnya. Sampai dengan inkubasi 21 hari, belum ada koloni aktinomisetes yang mampu
tumbuh pada medium isolasi tersebut. Dengan demikian pada tahap selanjutnya akan digunakan pra-perlakuan dengan metode ke-6 dan ke-7.
IV.2. Isolasi Aktinomisetes
Hasil isolasi aktinomisetes laut yang diambil dari tiga lokasi diperoleh 5 isolat dari pantai utara Cirebon, 29 isolat dari Pantai Anyer Banten, dan 6 isolat
dari Pantai Kukup Gunung Kidul Yogyakarta. Jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi setiap bobot sampel sedimen laut relatif lebih sedikit dibandingkan
dengan isolasi aktinomisetes dari tanah. Namun demikian potensi untuk mendapatkan mikroba unggul dari aktinomisetes laut lebih besar karena kondisi
lingkungan laut yang lebih bervariasi dibandingkan di tanah. Menurut Goodfellow 1983 bahwa walaupun jumlah aktinomisetes yang dapat diisolasi dari laut
cenderung lebih sedikit dibandingkan dari tanah namun demikian karakteristik aktinomisetes laut lebih bervariasi dan lebih berpotensi.
Pada komposisi medium isolasi dan sejumlah antibiotik yang ditambahkan sama, maka apabila dilihat dari kedua proses pra-perlakuan yaitu dengan
menggunakan panas heatshock treatment dan menggunakan pengasaman acid treatment
maka terlihat bahwa pra-perlakuan dengan pemanasan lebih efektif dibandingkan pra-perlakuan dengan pengasaman. Praperlakuan pemanasan
terbukti mampu menekan pertumbuhan bakteri kontaminan yang biasanya akan tumbuh pada awal inkubasi. Sebaliknya pra-perlakuan asam terbukti masih
banyak bakteri kontaminan yang tumbuh dan menyebabkan sulitnya proses pemurnian koloni aktinomisetes. Menurut Hoskisson et al. 2000 perlakuan
pemanasan sampel pada 60 °C mampu meningkatkan 5 kali jumlah spora Micromonospora echinospora
yang dikulturkan dibandingkan tanpa pemanasan. Disamping mampu menekan bakteri kontaminan perlakuan pemanasan terbukti
mampu meningkatkan aktivasi proses respirasi spora dan memacu penggunaan senyawa yang digunakan. Apabila pemanasan dinaikkan menjadi 70 °C, maka
waktu yang dibutuhkan untuk proses aktivasi menjadi lebih pendek, namun terjadi pengurangan jumlah spora yang dikulturkan. Pemanasan sampel pada suhu 50 °C
selama 30 menit tidak berpengaruh tarhadap pertumbuhan spora yang dikulturkan dibandingkan kontrol. Hal yang sama disampaikan oleh Karwowski 1986 bahwa
pemanasan pada suhu 70 °C dalam waktu lebih dari 30 menit berpotensi mengurangi jumlah spora yang dapat dikulturkan pada medium isolasi. Hal yang
