siklotirosil-prolil mengikuti jalur yang pertama, yaitu asam amino terlibat langsung dalam biosintesis antibiotik. Hal ini dikuatkan dari penggunaan sumber
nitrogen pepton dan kasein yang mengandung asam amino menghasilkan produktivitas siklotirosil-prolil yang lebih tinggi. Lautru et al. 2002
menjelaskan bahwa biosintesis siklophe-leu disusun oleh asam amino phenil alanin dengan leusin secara langsung dari asam amino, masing-masing asam
amino diaktifkan oleh siklodipeptida sintetase CDPSs melalui gen AlbC. Sampai saat ini belum ada literatur yang menjelaskan mengenai biosintesis pembentukan
siklotirosil-prolil. Biosintesis pembentukan siklotirosil-prolil diduga melalui jalur pengaktifan asam amino tirosin dan prolin dengan menggunakan
siklodipeptida sintetase seperti yang dijelaskan oleh Lautru et al. 2002. Kemungkinan reaksi pembentukan siklotirosil-prolil terjadi adalah seperti yang
disajikan dalam Gambar 23.
HO O
O H
HN N
H
2 +
- H
3 +
-
+
siklodipeptida sintetaseCDPSs
prolin tirosin
siklotirosil-prolil
Gambar 23 Reaksi pembentukan siklotirosil-prolil
Apabila dilihat dari komposisi asam amino dari sumber nitrogen pepton, kasein, dan ekstrak khamir, terlihat bahwa ketiga sumber nitrogen ini
mengandung asam amino prolin dan tirosin dalam bentuk bebas dan terikat dalam protein seperti yang disajikan dalam Tabel 12.
Pepton mengandung total prolin, tirosin bebas, dan total tirosin yang lebih tinggi dibandingkan kasein dan ekstrak khamir. Kasein mengandung jumlah
prolin bebas, total prolin, tirosin bebas, dan total tirosin yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak khamir. Konsentrasi siklotirosil-prolil yang
dihasilkan oleh pepton dan kasein lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak khamir. Hal ini mendukung dugaan bahwa biosintesis siklotirosil-prolil
dipengaruhi oleh adanya asam amino prolin dan tirosin dalam medium fermentasi seperti yang dijelaskan oleh Lautru et al. 2002.
Tabel 12 Kandungan prolin dan tirosin dalam pepton, kasein, dan ekstrak khamir.
Sumber Nitrogen Komplek
Prolin Bebas Total Prolin
Tirosin Bebas Total Tirosin
Pepton Difco 0,3
8,8 0,5
0,6 Kasein Difco
0,5 8,0
0,4 0,4
Ekstrak khamir Difco
0,3 2,3 0,1 0,2 sumber: katalog Difco 2004.
Penggunaan sumber nitrogen asam glutamat terlihat mampu menghasilkan siklotirosil-prolil walaupun lebih kecil dibandingkan dengan pepton, kasein, dan
ekstrak khamir. Hal ini dapat dijelaskan bahwa asam glutamat merupakan lintasan dalam pembentukan asam amino prolin melalui L-glutamil-
γ-phosphate, glutamic- γ-semialdehyde GSA, dan pyroline-5-carboxylate seperti yang disajikan dalam
Gambar 24. Dengan demikian glutamat berperan dalam preursor pembentukan prolin.
Gambar 24 Biosintesis prolin melalui lintasan asam glutamat
http:www.hort.purdue.edurhodcvhort640cprolinepr00003.htm
Selain berperan sebagai prekursor pembentukan prolin, asam glutamat juga berperan dalam pembentukan tirosin. Sebagai sumber nitrogen, glutamat
berperan dalam proses transaminase pembentukan tirosin melalui p- hydroxyphenylpyruvate
seperti yang disajikan dalam Gambar 25.
Gambar 25 Biosintesis tirosin melalui transaminase p-hydroxyphenylpyruvate
http:en.wikibooks.orgwikiPrinciples_of_BiochemistrySynthesis_of_aminoacids.
Pepton juga menjadi sumber nitrogen terbaik pada produksi antibiotik oxytetracycline menggunakan isolat Streptomyces rimosus Abou-Zeid et al.
1981 dan menjadi sumber nitrogen terbaik pada produksi antibiotik streptolydigin menggunakan isolat Streptomyces lydicus AS 4.2501. Liangzhi et
al. 2007.
IV.11. Penentuan Mineral Terbaik untuk Produksi Siklotirosil-prolil
Mineral merupakan salah satu penyusun medium fermentasi yang memiliki pengaruh terhadap produksi antibiotik. Menurut Stanbury dan Whitaker
1987, mineral memiliki peran penting dalam reaksi enzim, yaitu sebagai kofaktor pada proses metabolisme. Kombinasi campuran mineral juga berperan
penting dalam regulasi elektrolitik dan osmotik dalam sel. Menurut Vogel dan Todaro 1996, kebutuhan mineral pada fase pembentukan metabolit primer atau
sekunder lebih tinggi dibandingkan pada fase pembentukan biomassa sel. Hal ini berkaitan dengan keterlibatan mineral dalam metabolisme pembentukan metabolit
primer dan sekunder. Reaksi enzim dalam proses metabolisme membutuhan beberapa macam
campuran mineral. Sebagai contoh kebutuhan garam fosfat pada kisaran 0,3 sampai dengan 300 mM umumnya dibutuhkan untuk pertumbuhan sel, namum
demikian pada fase stasioner keberadaan garam fosfat akan merepresi pembentukan antibiotik Martin dan Demain 1980. Reaksi biosintesis antibiotik
banyak melibatkan reaksi enzim dalam metabolismenya. Dalam setiap reaksi enzim dibutuhkan mineral atau ion logam yang bervariasi. Beberapa ion logam
bersifat menghambat reaksi namun ada yang mempercepat reaksi enzim. Penentuan awal kebutuhan jumlah dan jenis mineral didalam medium fermentasi
memang sulit ditentukan. Selain bersifat sedikit jumlahnya dalam setiap volume medium juga terdapat jenis mineral yang bersifat toksik dan menghambat
pertumbuhan mikroba. Penghambatan salah satu jenis mineral terhadap jenis mikroba tertentu tidak bersifat umum.
Pada penelitian ini ditentukan komposisi mineral yang mengacu dari beberapa referensi seperti yang telah disampaikan dalam Bab III. Dari hasil
percobaan terlihat bahwa mineral I dengan komposisi K
2
HPO 1 g L
-1
, MgSO
4 4.
7 H
-1 -1
-1
O 0,025 g L , ZnSO 7 H O 0,025 g L , CaCl
2 4
2 2
.2 H O 0,025 g L , FeSO
2 4
7 H
-1
O 0,025 g L
2
Sousa et al. 2001 menunjukkan konsentrasi yang paling tinggi Gambar 26.
5 10
15 20
25 30
35 40
blanko mineral I
mineral II mineral III
mineral IV mineral V
garam mineral ko
n sen
tr asi
si kl
o t
ir o
si l-
p ro
li l
m g
L
Gambar 26 Pengaruh campuran beberapa mineral terhadap konsentrasi siklotirosil-prolil.
Hasil analisis ragam Lampiran 15 menunjukkan bahwa perlakuan terhadap beberapa campuran mineral berpengaruh nyata terhadap konsentrasi
antibiotik yang dihasilkan. Hasil Uji Duncan dengan taraf nyata α 0,05
menunjukkan bahwa konsentrasi antibiotik yang dihasilkan oleh mineral I adalah yang terbaik dan berbeda nyata dengan mineral lainnya.
Dalam jumlah yang sedikit, mineral memiliki pengaruh terhadap pertumbuhan sel dan pembentukan produk. Menurut Stanbury dan Whitaker
1987 diantara logam dan mineral yang dibutuhkan oleh mikroba, mangan, besi, dan seng adalah jenis mineral yang paling banyak dibutuhkan. Dalam batas
konsentrasi tertentu mineral mampu meningkatkan pertumbuhan sel dan pembentukan produk, namun pada konsentrasi berlebih akan menjadi toksik dan
menyebabkan lisis sel. Menurut Hassan et al. 2001 penambahan magnesium sulfat dalam medium fermentasi menggunakan isolat Streptomyces violatus
mampu menaikkan konsentrasi senyawa antimikroba sebesar 4 kali. Hal yang sama disampaikan oleh Paul dan Banerjee 1983 penambahan tembaga, seng, dan
besi berpengaruh nyata terhadap produksi senyawa anti kapang menggunakan Streptomyces galbus
. Sementara itu penambahan kalsium, seng, dan besi juga berpengaruh nyata terhadap produksi neomisin menggunakan Streptomyces
fradiae Haque dan Mondal 2010.
IV.12. Optimasi Medium Fermentasi
Komposisi medium fermentasi mikroba secara umum disusun oleh sumber karbon, sumber nitrogen, vitamin dan mineral Stanbury dan Whitaker 1987.
Jenis dan konsentrasi setiap sumber karbon, nitrogen dan mineral setiap mikroba adalah berbeda tergantung dari tujuan dan target produk fermentasi yang
dikehendaki Vogel dan Todaro1996. Medium fermentasi untuk produksi protein sel tunggal atau metabolit primer jauh berbeda dengan komposisi medium
fermentasi untuk produksi metabolit sekunder. Pada penelitian ini optimasi medium fermentasi dilakukan dengan komposisi medium fermentasi terpilih yang
telah dilakukan pada percobaan sebelumnya, yaitu sumber karbon dekstrin, sumber nitrogen pepton dan komposisi mineral menurut Sousa et al. 2001.
Adapun kisaran dan taraf ketiga variabel terpilih disajikan dalam Tabel 13.
Tabel 13 Kisaran dan taraf variabel yang diuji pada optimasi komposisi medium
Kisaran dan taraf Variabel yang diuji
-1,68 -1 0 1 1,68
Konsentrasi dekstrin g L
-1
21,60 25 30 35
38,40 Konsentrasi pepton g L
-1
6,64 8
10 12
13,36 Penambahan mineral mL larutan
stok per liter kaldu fermentasi 3,30 5 7,50 10 11,70
Komposisi mineral larutan stok adalah; K
2
HPO
4
133,33 g L
-1
, MgSO
4.
7 H
2
O 3,3 g L
-1
, ZnSO
4
7 H
2
O 3,3 g L
-1
, CaCl
2
.2 H
2
O 3,3 g L
-1
, FeSO
4
7 H
2
O 3,3 g L
-1
.
Dari percobaan diperoleh respon antibiotik yang disajikan dalam Tabel 14. Data selengkapnya disajikan dalam Lampiran 16.
Tabel 14 Data hasil percobaan optimasi medium fermentasi Streptomyces sp. A11 menggunakan rancangan model komposit terpusat CCD.
No X1
X2 X3
respon antibiotik
mg L
‐1
Nilai dugaan
Total konsumsi
sumber karbon
g Respon
berbanding total
konsumsi sumber
karbon
1 ‐1
‐1 ‐1
19,13 17,19
19,12 1,00
2 1
‐1 ‐1
19,96 20,15
20,59 0,97
3 ‐1
1 ‐1
23,19 24,64
21,07 1,10
4 1
1 ‐1
40,35 36,28
22,94 1,76
5 ‐1
‐1 1
20,59 23,72
19,96 1,03
6 1
‐1 1
30,99 28,61
23,57 1,31
7 ‐1
1 1
35,67 34,54
22,61 1,58
8 1
1 1
47,11 48,11
23,00 2,05
9 ‐1,68
26,00 24,65
17,69 1,47
10 1,68
35,88 38,56
25,88 1,39
11 ‐1,68
16,74 16,89
19,52 0,86
12 1,68
38,37 39,55
22,90 1,68
13 ‐1,68
20,90 23,05
22,78 0,92
14 1,68
39,31 38,49
23,86 1,65
15 47,56
47,40 23,45
2,03 16
47,71 47,40
23,19 2,06
17 47,88
47,40 23,10
2,07 18
46,94 47,40
23,07 2,03
19 47,19
47,40 23,28
2,03 20
47,36 47,40
23,36 2,03
Dari beberapa model yang diuji Tabel 15 dan 16 ternyata model kuadratik merupakan model yang paling cocok untuk digunakan dalam percobaan
ini.
