Optimasi Medium Fermentasi Isolation, purification, identification, and fermentation medium optimization of antibiotic produced by marine actinomycetes

Untuk mendapatkan model persamaan matematik maka ditentukan estimasi koefisien regresinya. Hasil tabulasi data percobaan Tabel 13 diperoleh estimasi koefisien regresi seperti yang disajikan dalam Tabel 17. Tabel 17 Model koefisien regresi pada proses optimasi medium fermentasi untuk produksi siklotirosil-prolil. Faktor Koefisien Estimasi Derajat bebas Intercept 47,40 1 A ‐dekstrin 4,13 1 B ‐pepton 6,74 1 C ‐ mineral 4,59 1 AB 2,17 1 AC 0,48 1 BC 0,84 1 A 2 ‐5,59 1 B 2 ‐6,78 1 C 2 ‐5,88 1 CV: 6,8 Persamaan matematik model kuadratik optimasi produksi antibiotik siklotirosil-prolil adalah sebagai berikut; Y= 47,40 + 4,13X 1 + 6,74 X 2 + 4,59 X 3 + 2,17 X 1 X 2 – 5,59 X 1 2 - 6,78 X 2 2 – 5.88 X 3 2 . Y = produksi senyawa aktif mg L -1 X 1 = konsentrasi dekstrin g L -1 X 2 = konsentrasi pepton g L -1 X 3 = volume penambahan mineral mL. Untuk menentukan pengaruh masing-masing variabel dalam bentuk linier dan kuadratik atau interaksi antar variabel maka ditentukan nilai F p-value ProbF dalam analisis keragaman seperti yang disajikan dalam Tabel 18. Nilai Fvalue dan p-value ProbF menunjukkan signifikasi masing-masing variabel dekstrin, pepton, dan mineral dan model yang digunakan. Tabel 18 Analisis keragaman pada proses optimasi medium fermentasi untuk produksi siklotirosil-prolil Sumber Jumlah kuadrat Derajat bebas Kuadrat Tengah Nilai F Nilai p Prob F Model 2533,49 9 281,50 49,83 0,0001 A ‐dekstrin 233,30 1 233,30 41,30 0,0001 B ‐pepton 620,13 1 620,13 109,77 0,0001 C ‐ mineral 287,79 1 287,79 50,94 0,0001 AB 37,71 1 37,71 6,68 0,0272 AC 1,85 1 1,85 0,33 0,5795 BC 5,0 1 5,70 1,01 0,3390 A 2 449,57 1 449,57 79,58 0,0001 B 2 662,88 1 662,88 117,33 0,0001 C 2 498,35 1 498,35 88,21 0,0001 Residual 56,50 10 5,65 Total 2589,98 19 R 2 = 0,98; adj R 2 = 0,96; CV= 6,8 Dari Tabel 17 18 menunjukkan bahwa konsentrasi dekstrin memberikan pengaruh linear positif dan pengaruh kuadratik negatif terhadap produktivitas antibiotik, namun demikian pengaruh kuadratik negatif dektrin lebih besar dibandingkan dengan pengaruh linier positif, demikian juga dengan pengaruh pepton dan pengaruh mineral. Hal yang sama terjadi pada mineral, yaitu pengaruh kuadratik negatif lebih besar dibandingkan dengan pengaruh linier positif mineral. Pengaruh linier positif pepton memiliki nilai yang hampir sama dengan pengaruh kuadratik negatif. Apabila dilihat dari interaksi antar variabel, interaksi antara dektrin dengan pepton terlihat nyata dengan p-valueProbF 0,0272. Interaksi ini memiliki pengaruh positif terhadap kenaikan konsentrasi antibiotik. Dengan demikian perubahan konsentrasi masing-masing variabel ini akan saling mempengaruhi dan menentukan konsentrasi antibiotik yang dihasilkannya. Berbeda halnya dengan interaksi antara dekstrin dengan mineral dan pepton dengan mineral yang terlihat tidak nyata. Hasil uji kesahihan model secara statistik seperti yang disajikan dalam Tabel 18 menunjukkan bahwa model dugaan yang dikembangkan telah sesuai dan sangat nyata. Hal ini tampak dari hasil uji p-value ProbF menunjukkan nilai yang sangat kecil yaitu 0,0001. Sementara itu pengaruh linear dan kuadratik dari ketiga variabel yang digunakan bersifat sangat nyata p-value ProbF 0,0001, dan interaksi diantara ketiga variabel bersifat tidak nyata. Model kuadratik yang dikembangkan memiliki nilai CV sebesar 6,8 yang menunjukkan bahwa derajat ketepatan precision dari perlakuan yang dibandingkan cukup tinggi, yaitu semakin kecil nilai CV maka derajat ketepatan dari perlakuan yang dibandingkan semakin tinggi Montgomery 1997. Uji kenormalan galat model Normality Test menunjukkan bahwa galat model telah terdistribusi secara normal dan saling bebas dengan keragaman yang relatif homogen Gambar 27. Hal yang sama ditunjukkan pada Gambar 28, plot antara galat dengan urutan percobaan dan Gambar 29 plot antara galat dengan nilai dugaan. Dari kedua gambar tersebut menunjukkan tidak ada pola tertentu yang mengindikasikan bahwa model regresi yang digunakan dapat menjelaskan data yang digunakan. Residual N or m al P rob abi lit y Normal Plot of Residuals -3.12906 -1.32966 0.469733 2.26913 4.06853 1 5 10 20 30 50 70 80 90 95 99 Plot Normal Galat Galat Prob ab ilitas n o rmal Gambar 27 Plot probabilitas normal galat model produktivitas siklotirosil-prolil yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11. Run Number Int e rnal ly S tudent iz ed R es idu a ls Residuals vs. Run -3.00 -1.50 0.00 1.50 3.00 1 4 7 10 13 16 19 Galat mod el Galat vs urutan percobaan Urutan percobaan Gambar 28 Plot urutan percobaan versus galat model produktivitas siklotirosil- prolil yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11 Gambar 29 Plot nilai dugaan versus galat model pada produktivitas siklotirosil- prolil yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11 Predicted Int er nal ly S tud ent iz ed R es idu a ls Residuals vs. Predicted -3.00 -1.50 0.00 1.50 Nilai dugaan VS Galat Model 3.00 Galat mod el 16.89 24.69 32.50 40.31 48.11 Nilai Dugaan Hubungan antara variabel dapat digambarkan dengan menggunakan permukaan respon dan plot kontur. a Permukaan respon hubungan antara dekstrin dengan pepton produksi antibiotik C : mineral = 0 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 12.75 25.5 38.25 51 ak ti v it a s an ti biot ik A: dekstrin B: peptone Konsentras i antib ioti k A: dekstrin B: pepton -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 aktivitas antibiotik A: dekstrin B: p e p to n e 8.68771 8.68771 17.0156 25.3435 33.6714 41.9993 41.9993 6 6 6 6 6 6 Konsentrasi antibiotik b Plot kontur hubungan antara dektrin dan pepton produksi antibiotik Gambar 30 Permukaan respon dan plot kontur produksi siklotirosil-prolil sebagai pengaruh dekstrin dan pepton. Hubungan antara variabel dekstrin dan pepton dapat digambarkan dalam bentuk plot kontur dan permukaan respon seperti yang disajikan dalam Gambar 30. Gambar 30 menunjukkan bahwa kenaikan konsentrasi dektrin dan pepton berpengaruh nyata terhadap produksi siklotirosil-prolil, dan kenaikan konsentrasi pepton terlihat lebih berpengaruh pada produksi siklotirosil-prolil dibandingkan dengan kenaikan konsentrasi dekstrin. Pada penambahan konsentrasi dekstrin di atas 30 g L -1 level 0 dan konsentrasi pepton di atas 10 g L -1 level 0, mengakibatkan penurunan konsentrasi antibiotik. Menurunnya konsentrasi antibiotik pada penambahan konsentrasi dekstrin dan pepton level 0 dapat disebabkan oleh dua kemungkinan, pertama; terjadi hambatan oleh substrat atau disebut represi katabolit. Menurut Wang et al. 1979 beberapa sumber nitrogen dan sumber karbon berlebih dapat menyebabkan penghambatan oleh substrat. Penghambatan oleh substrat tidak hanya diakibatkan oleh glukosa saja, namun dapat disebabkan oleh senyawa lain seperti sumber karbon lain, sumber nitrogen maupun mineral Wang et al. 1979. Penyebab yang kedua adalah berkurangnya transfer oksigen dalam medium karena viskositas medium meningkat dengan meningkatnya konsentrasi dektrin dan pepton. Streptomyces sp. termasuk dalam golongan mikroba aerobik yang memerlukan oksigen untuk pertumbuhan selnya. Dengan berkurangnya transfer oksigen di dalam medium, pertumbuhan sel menjadi kurang optimal Goodfellow et al. 1988. Apabila dihubungkan dengan model monod Vogel dan Todaro 1996 dalam kondisi konsentrasi substrat rendah, penambahan konsentrasi substrat akan menambah laju pertumbuhan spesifik, namun pada batas tertentu konsentrasi substrat tidak berpengaruh nyata terhadap laju pertumbuhan spesifik, sehingga laju pertumbuhan sel konstan, dan dapat terjadi penghambatan oleh substrat itu sendiri. Pada konsentrasi dektrin dan pepton berturut-turut dibawah 30 g L -1 dan 10 g L -1 terjadi penurunan konsentrasi antibiotik, hal ini dapat disebabkan oleh kemampuan produksi siklotirosil-prolil yang sepenuhnya belum dipenuhi oleh kecukupan pasokan sumber karbon dan nitrogen. Hal ini dapat dilihat dari kenaikan konsentrasi dektrin dan pepton dari titik -1,68 naik sampai dengan titik 0 yang mengakibatkan kenaikan konsentrasi siklotirosil-prolil secara terus- menerus. Namun setelah tercapai titik optimum, kenaikan konsetrasi dektrin dan pepton tidak mengakibatkan kenaikan konsentrasi siklotirosil-prolil. Pola pengaruh interaksi antara dektrin dan pepton cenderung menguatkan produksi siklotirosil-prolil Gambar 31. Pada konsentrasi sumber karbon dekstrin 30 g L -1 atau titik pusat perlakuan 0 dan perlakuan titik pusat mineral adalah 0, perubahan konsentrasi pepton sampai dengan perlakuan titik pusat 0 terlihat berpengaruh nyata terhadap kenaikan produktivitas antibiotik. Namun demikian pada perlakuan titik pusat konsentrasi sumber karbon 0, perlakuan pepton pada +1,68 terjadi penurunan produktivitas antibiotik. Hal berbeda pada konsentrasi sumber karbon 38,4 g L -1 atau titik pusat perlakuan +1,68, penambahan konsentrasi sumber nitrogen sampai dengan perlakuan +1,00 terlihat masih lebih tinggi konsentrasi antibiotiknya dibandingkan konsentrasi sumber nitrogen pada perlakuan titik pusat 0. Gambar 31 Pola pengaruh dekstrin dan pepton terhadap produksi siklotirosil- prolil. Hubungan antara variabel konsentrasi dekstrin dengan konsentrasi mineral dalam bentuk plot kontur dan permukaan respon disajikan dalam Gambar 32. Design-Expert® Sof tware aktiv itas antibiotik Design Points B- -1.000 B+ 1.000 X1 = A: dekstrin X2 = B: peptone Actual Factor C: garam mineral = 0.00 B: peptone -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 Interaction Interaksi A: dekstrin ak ti v it as an ti bi ot ik 11.2176 21.1632 31.1088 41.0544 Konsentrasi antibiotik B: pepton 51 3 3 2 2 2 3 B1,68 B0 B-1,68 B0 B0 Konsentrasi antibiotik -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 1 13.25 25.5 37.75 50 A: dekstrin C: garam mineral a k ti vi ta s a n ti b io ti k B: pepton = 0 Konsentrasi antibioti k C: mineral A: dekstrin a Permukaan respon hubungan antara dekstrin dengan mineral produksi antibiotik -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 aktivitas antibiotik A: dekstrin C : ga ra m m ine ra l Konsentrasi Antibiotik 6 6 6 6 6 6 41.2308 33.3332 25.4357 17.5382 9.64072 17.5382 b Plot kontur hubungan antara dekstrin dengan mineral produksi antibiotik Gambar 32 Permukaan respon dan plot kontur produksi siklotirosil-prolil sebagai pengaruh dekstrin dan mineral. Gambar 32 terlihat bahwa penambahan konsentrasi dekstrin dan mineral dari level -1,68, terjadi kenaikan produktivitas antibiotik. Namun demikian penambahan konsentrasi dekstrin dan mineral pada level 0 terjadi penurunan konsentrasi antibiotik. Pengaruh konsentrasi dekstrin terhadap produktivitas antibiotik relatif sama dengan pengaruh konsentrasi mineral, tetapi interaksi antara dua variabel ini tidak nyata. Perubahan konsentrasi dekstrin terhadap produktivitas antibiotik tidak mempengaruhi perubahan konsentrasi mineral terhadap produktivitas antibiotik, demikian juga sebaliknya. Hal yang menyebabkan terjadinya penurunan konsentrasi siklotirosil-prolil akibat penambahan konsentrasi dekstrin dan mineral pada level 0 sampai dengan level -1,68 diduga disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu pertama; terjadinya penghambatan oleh substrat dekstrin, kedua; naiknya viskositas kaldu fermentasi yang menyebabkan transfer oksigen menjadi turun, ketiga; terjadinya efek toksik oleh mineral akibat sensitifitas sel terhadap mineral pada konsentrasi tertentu. Menurut Stanbury dan Whitaker 1987 kebutuhan mineral terhadap pertumbuhan sel mikroba tidak berlaku hubungan linier atau berbanding lurus. Pada konsentrasi mineral yang melebihi batas toleransi sel, justru akan menghambat pertumbuhan sel. Menurut Abbas dan Edwards 1990 penambahan magnesium dan kalsium dalam batas konsentrasi tertentu berpengaruh nyata terhadap penurunan produktivitas antibiotik actinohordin oleh Streptomyces coelicolor. Hubungan antara variabel konsentrasi nitrogen dengan konsentrasi mineral dalam bentuk plot kontur dan permukaan respon disajikan dalam Gambar 33. Gambar 33 menunjukkan bahwa penambahan konsentrasi pepton dan mineral pada level -1,68 sampai dengan 0 terjadi kenaikan produktivitas antibiotik. Namun penambahan konsentrasi pepton dan mineral pada level 0 sampai dengan level 1,68 terjadi penurunan produktivitas antibiotik. Penurunan produktivitas antibiotik pada konsentrasi pepton dan mineral tinggi dapat diakibatkan oleh hambatan oleh subtrat atau efek toksik dari mineral. Pengaruh kenaikan konsentrasi antibiotik lebih banyak dipengaruhi oleh konsentrasi nitrogen dibandingkan dengan konsentrasi mineral, dan interaksi antara dua variabel ini relatif tidak nyata, atau perubahan konsentrasi nitrogen terhadap konsentrasi antibiotik tidak mempengaruhi perubahan konsentrasi mineral terhadap konsentrasi antibiotik, demikian juga sebaliknya. -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -5 9 23 37 51 a k ti v ita s a n ti b io ti k B: peptone C: garam mineral A: dekstrin = 0 Kon sen trasi antib io tik B : Pepton C: mineral B: pepton a Permukaan respon hubungan antara pepton dengan mineral produksi antibiotik -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 -1.68 -0.84 0.00 0.84 1.68 aktivitas antibiotik B: peptone C : ga ram m iner al 4.20041 13.3893 22.5781 22.5781 31.767 40.9559 40.9559 6 6 6 6 6 6 Konsentrasi antibiotik B: Pepton b Plot kontur hubungan antara pepton dengan mineral produksi antibiotik Gambar 33 Permukaan respon dan plot kontur produksi siklotirosil-prolil sebagai pengaruh pepton dan mineral.

IV.13. Formulasi Medium dan Validasi Model

Melalui program Design Expert 7 dapat ditentukan nilai optimal variabel dekstrin, pepton, dan mineral. Hasil analisis diperoleh peubah-peubah dalam unit yang dikodekan, yaitu X 1 = 0,51; X 2 = 0,61; X 3 = 0,46 dengan respon yang dihasilkan nilai yang diduga sebesar Y = 51,54. Keluaran variabel hasil optimasi menggunakan Design Expert 7 disajikan dalam Lampiran 17e. Nilai asli peubah- peubah adalah konsentrasi dekstrin sebesar 32,55 g L -1 , konsentrasi pepton sebesar 11,22 g L -1 , dan penambahan mineral sebesar 8,65 mL. Hasil percobaan di laboratorium proses fermentasi selama 144 jam dengan komposisi medium konsentrasi dekstrin sebesar 32,55 g L -1 , pepton 11,22 g L -1 , mineral 8,65 mL, air demineral 250 mL, air laut 750 mL dengan pH awal 7,5 diperoleh konsentrasi siklotirosil-prolil sebesar 50,04 mg L -1 . Data pengamatan konsentrasi siklotirosil-prolil dan konsumsi gula pada proses validasi model percobaan di laboratorium disajikan dalam Lampiran 18. Nilai konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkan dari percobaan terlihat 2,9 lebih kecil dibandingkan dengan nilai dugaan respon dari model matematik yang digunakan. Perbedaan nilai dugaan respon dari model dengan nilai respon hasil percobaan di laboratorium sebesar 2,9 menunjukkan bahwa model yang digunakan telah sesuai dan mampu menjelaskan data percobaan yang digunakan. Dibandingkan dengan konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkan menggunakan medium standar sebelum dilakukan proses optimasi sebesar 20 mg L -1 , maka proses optimasi medium fermentasi ini terjadi penambahan konsentrasi siklotirosil-prolil sebesar 2,5 kalinya , yaitu sebesar 50 mg L -1 . V KESIMPULAN DAN SARAN

V.1. Kesimpulan

Isolasi aktinomisetes laut dapat dilakukan dengan menggunakan medium starch -kasein-agar. Untuk menekan pertumbuhan bakteri dan kapang kontaminan dapat ditambahkan sikloheksimid 100 μg mL -1 , nistatin 45 μg mL -1 , asam nalidiksat 30 μg mL -1 , rifampisin 10 μg mL -1 . Pra-perlakuan sampel dengan pemanasan pada suhu 60 °C selama 4 jam atau pengasaman sampel pada pH 2 selama 2 jam mampu mengurangi pertumbuhan mikroba kontaminan. Sebanyak 40 isolat aktinomistes yang berhasil diisolasi dari Pantai Barat Banten, Pantai Selatan Yogyakarta, dan Pantai Utara Cirebon diketahui 4 isolat mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli ATCC 25922, 5 isolat menghambat Staphylococcus aureus ATCC25923, 4 isolat menghambat Bacillus subtilis ATCC 66923, 4 isolat menghambat Pseudomonas aeroginosa ATCC27853, 4 isolat menghambat Candida albican BIOMCC00122, dan 4 isolat menghambat Aspergillus niger BIOMCC00134. Isolat A11 sebagai isolat terpilih, memiliki aktivitas hambatan paling kuat terhadap bakteri Gram-positif dan Gram- negatif. Hasil identifikasi menggunakan 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat A11 adalah Streptomyces sp. homology 100. Hasil analisis menggunakan LC-MS diketahui bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 memiliki bobot molekul sebesar 260 g mol -1 dan rumus molekul C 14 H 16 N 2 O 3. Hasil elusidasi struktur molekul menggunakan 1 HNMR, 13 C NMR, DEPT 13 C NMR, dan FTIR menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp.A11 adalah siklotirosil-prolil yang memiliki titik leleh sebesar 140 °C. Minimum Inhibitory Concentration MIC siklotirosil-prolil yang dihasilkan oleh Streptomyces sp.A11 terhadap Escherichia coli ATCC 25922 adalah sebesar 27 μg mL -1 , Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 sebesar 69 μg mL -1 , Staphylococcus aureus ATCC 25923 sebesar 80 μg mL -1 , and Bacillus subtilis ATCC 66923 sebesar 74 μg mL -1 . Profil fermentasi isolat Streptomyces sp. A11 dalam medium glukosa- khamir-pepton menunjukkan bahwa fase lag terjadi sampai dengan jam ke-8, fase pertumbuhan cepat fase logaritma terjadi pada selang waktu jam ke-9 sampai dengan jam ke-48, dan fase stasioner terjadi pada selang waktu jam ke-48 sampai dengan jam ke-144. Pada fase pertumbuhan cepat fase logaritma laju pertumbuhan maksimum μ sebesar 0,04 jam dan rendemen pembentukan maks -1 biomassa per massa substrat Y sebesar 0,6 gram biomassa per gram gula. Suhu xs 30 °C dan kisaran pH 6,5 sampai dengan pH 7,5 merupakan kondisi terbaik untuk proses produksi siklotirosil-prolil. Hasil optimasi medium fermentasi menggunakan variabel bebas dektrin, pepton, dan campuran mineral I referensi menurut Sousa et al. 2001 menunjukkan pengaruh nyata terhadap konsentrasi siklotirosil-prolil. Pepton memberikan pengaruh yang paling kuat dibandingkan dekstrin dan mineral. Terdapat interaksi nyata diantara pepton dengan dekstrin. Namun demikian tidak ada interaksi nyata diantara pepton dengan mineral dan dekstrin dengan mineral. Model matematik produksi siklotirosil-prolil yang diperoleh dalam optimasi adalah Y= 47,40 + 4,13X 1 + 6,74 X 2 + 4,59 X 3 + 2,17 X 1 X 2 – 5,59 X 1 2 - 6,78 X 2 2 – 5.88 X 3 2 , dengan variabel yang menunjukkan respon paling optimum adalah konsentrasi dekstrin X 1 sebesar 32,55 g L , konsentrasi pepton X -1 2 sebesar 11,22 g L dan penambahan mineral X sebesar 8,65 mL dan dugaan -1 3 respon yang diperoleh adalah sebesar 51,54 mg L . Hasil validasi model yang -1 dilakukan dilaboratorium diperoleh konsentrasi siklotirosil-prolil pada fermentasi jam ke-144 adalah sebesar 50,04 mg L . Perbedaan nilai dugaan -1 respon dengan percobaan dilaboratorium adalah sebesar 2,9.

V.2. Saran

Pada proses produksi metabolit sekunder sangat ditentukan oleh mekanisme lintasan metabolisme pathway yang terjadi. Dari hasil penelusuran beberapa literatur, sampai saat ini belum ada literatur yang memberikan informasi mengenai lintasan metabolisme pembentukan siklotirosil-prolil ataupun enzim-enzim yang terlibat dalam metabolisme pembentukan siklotirosil-prolil. Untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan pengamatan enzim-enzim yang terlibat dalam proses metabolisme pembentukan siklotirosil-prolil. Disamping itu perlu dilakukan pengamatan gen-gen yang bertanggung jawab dalam proses pembentukan siklotirosil-prolil. Dengan demikian produktivitas antibiotik masih dapat ditingkatkan kembali. Selain variabel komposisi medium fermentasi, variabel proses fermentasi seperti aerasi dan agitasi juga berpengaruh terhadap produktivitas antibiotik. Variabel aerasi dan agitasi dapat dipelajari dengan menggunakan fermentor. Penelitian selanjutnya disarankan untuk menguji pengaruh aerasi, agitasi, dan suhu fermentasi secara simultan terhadap peningkatan produktivitas antibiotik dengan menggunakan fermentor.