Isolasi Aktinomisetes Isolation, purification, identification, and fermentation medium optimization of antibiotic produced by marine actinomycetes

tergantung dari kandungan airnya untuk mengurangi populasi bakteri Hayakawa dan Hideo 1987. Untuk memperbesar kemungkinan isolasi aktinomisetes dari sampel air, misalnya Rhodococcus dan Micromonospora dapat dilakukan pemanasan sampel 55 °C selama beberapa menit Goodfellow et al. 1988. Untuk mendapatkan Streptomyces telah digunakan medium khusus yaitu Medium International Streptomyces Project ISP Horan 1999. Fungi dapat dihilangkan dengan menambahkan antifungi seperti nistatin atau sikloheksimid ke dalam medium, dan bakteri dapat dieliminasi dengan menambahkan beberapa antibiotik ke dalam medium. Selain itu parameter kondisi lingkungan juga harus diperhatikan seperti pH, suhu dan sebagainya. Sebagian besar bakteri lebih peka terhadap pH asam, sedangkan fungi lebih tahan terhadap rentang pH yang lebih lebar. Suhu inkubasi dapat meningkatkan isolasi mikroba yang dikehendaki, misalnya isolasi Thermoactinomyces dapat ditingkatkan dengan inkubasi 50-55 °C, Nocardia pada 25 °C, Streptosporangium pada 40 °C dan sebagainya. Isolasi anggota aktinomisetes pada umumnya menggunakan suhu inkubasi 28 – 30 °C. Aktinomisetes merupakan mikroba yang paling efektif dalam menggunakan substrat. Sebagai organisme heterotrop, aktinomisetes memerlukan bahan organik sebagai sumber karbon bagi kelangsungan hidupnya dan beberapa jenis diantaranya mampu mendegradasi inulin dan chitin. Bahkan Nocardia sp mampu memecah molekul organik yang tak lazim di alam seperti parafin, fenol, steroid dan pirimidin. Micromonospora mampu mendekomposisi pati, chitin, selulosa, glukosida, pentosan dan mungkin lignin. Atas dasar kemampuannya yang jarang dijumpai pada mikroba lain, maka para ahli telah mengembangkan medium isolasi yang hanya menguntungkan pertumbuhan aktinomisetes daripada mikroba yang lain. Medium tersebut seperti Arginine-Glycerol salt, Benedict, Collodial Chitin, Starch-Casein dan sebagainya Cross 1982. Menurut Pisano et al. 1989 medium campuran pati dengan kasein sangat cocok digunakan untuk isolasi aktinomisetes. Aktinomisetes mudah tumbuh dalam medium campuran pati dan kasein, namun demikian mikroba lain tumbuh lebih lama dibandingkan dengan aktinomisetes. Beberapa teknik perlakuan pendahuluan sampel juga telah digunakan peneliti untuk mendapatkan isolat aktinomisetes yang diinginkan. Sebagai contoh teknik rehidrasi diterapkan pada sampel pada habitat air tawar yang akan menghasilkan banyak actinoplanete dan genus baru Cupolomyces. Spora aktinomisetes biasanya tahan terhadap proses pengeringan baik proses pengeringan kering atau basah. Pemanasan sampel pada suhu hangat mampu menekan pertumbuhan bakteri gram negatif yang sering mengganggu proses isolasi aktinomisetes Pisano 1986. Cara lain untuk menekan perumbuhan bakteri gram negatif adalah dengan mengurangi water activity pada medium isolasi. Kelembaban pada permukaan agar dapat mendorong tumbuh dan menyebarnya bakteri Gram-negatif yang secara signifikan dapat menekan proses germinasi dan pertumbuhan aktinomisetes. Oleh karena itu cawan isolasi dan permukaan agar harus dalam kondisi kering pada saat menyebarkan sampel isolasi Seong 2001. Beberapa spesies aktinomisetes lebih menyukai permukaan medium kering untuk proses germinasi dan pertumbuhan. Proses pemanasan dan pengeringan dengan kombinasi medium selektif akan mampu menghasilkan koloni aktinomisetes yang relatif banyak. Sentrifugasi diferensial juga dapat digunakan dalam proses pra-perlakuan sampel Araujo 2008. Spora aktinomisetes juga tahan terhadap pemanasan kering sampai suhu 120 °C, sifat ini dimanfaatkan untuk perlakuan pendahuluan yang dapat menghilangkan sejumlah bakteri kontaminan Takashi 2003. Spora aktinomisetes lebih sentisitif terhadap pemanasan basah, yaitu sampel tersuspensi dalam pelarut yang dipanaskan. Pemanasan sampel pada suhu 45-50 °C dapat digunakan untuk isolasi Streptomyces, pada suhu pemanasan 55 °C dapat digunakan untuk mengisolasi Rhodococcus, dan spesies yang lebih tahan pada pemanasan yang lebih tinggi lagi adalah Micromonospora yang dapat bertahan pada pemanasan 60-70 °C selama 30 menit. Perlakuan pendahuluan sampel secara kimia juga banyak dilakukan untuk mengisolasi aktinomisetes, misalnya penggunaan fenol, klor atau amonium kuartener. Metode pra-perlakuan ini biasanya juga mengurangi sejumlah aktinomisetes yang akan diisolasi Goodfellow et al. 1988. Seong et al. 2001 telah melakukan modifikasi pra-perlakuan sampel untuk isolasi aktinomisetes dari tanah. Isolasi dilakukan dengan medium HHVA Hair Hydrolysate Vitamin Agar dan pra-perlakuan sampel dengan menggunakan 4 metode, yaitu dengan penambahan antibiotik, pemanasan kering 1 jam pada suhu 100 °C, pemanasan basah 70 °C selama 15 menit, dan udara kering selama 24 jam. Dari penelitian ini menunjukkan bahwa hasil isolasi aktinomisetes dengan beberapa metode pra-perlakuan sampel tersebut menunjukkan hasil yang sangat bervariatif. Penggunaan senyawa antibakteri dan antifungi juga menentukan hasil isolasi aktinomisetes. Penggunakan senyawa antibakteri dapat memberikan efek mengurangi jumlah aktinomisetes yang akan diisolasi. Namun demikian cara ini dipandang sangat membantu menekan sejumlah bakteri dan kapang kontaminan, sehingga mempermudah proses isolasi dan pemurnian aktinomisetes. Kombinasi benzyl penicillin 5-10 μg mL -1 dengan asam nalidiksat 15 μg mL -1 dapat digunakan untuk mendapatkan Saccharothrix, novobiocin 25 μg mL -1 dan streptomycin 15 μg mL -1 dapat digunakan untuk mendapatkan isolat dari genus Glycomyces, dan dengan menambahkan vancomycin dapat digunakan untuk mendapatkan Amylocolatopsis. Hanka 1985 dapat menaikkan perolehan koloni Streptoverticillium dengan menggunakan medium agar yang mengandung oxytetracycline dengan metode filter membran yang dapat menghilangkan koloni bakteri nonmiselia. Salah satu faktor yang penting dalam proses isolasi dan fermentasi aktinomisetes adalah suhu inkubasi. Secara umum aktinomisetes tumbuh baik pada suhu 25 sampai dengan 30 °C. Namun demikian ada beberapa aktinomisetes yang tumbuh baik pada suhu 45 °C Goodfellow et al. 1988. Isolasi aktinomisetes termofilik akan lebih mudah diisolasi dan dimurnikan dari bakteri kontaminan dibandingkan jenis mesofilik. Namun pada proses produksinya aktinomisetes termofilik akan membutuhkan biaya yang cukup tinggi untuk tetap menjaga panas yang lebih tinggi. Waktu inkubasi proses isolasi aktinomisetes pada cawan agar sampai dapat dilihat koloninya dengan mata telanjang kurang lebih selama 7 sampai dengan 14 hari. Masa inkubasi yang semakin lama biasanya dihindari oleh peneliti. Hal ini disebabkan pertumbuhan aktinomisetes yang lambat akan meningkatkan biaya produksi pada saat masuk dalam proses fermentasi. Namun demikian pertumbuhan aktinomisetes dapat dimodifikasi melalui medium pertumbuhan dan kondisi lingkungan yang digunakan Cross 1982.

II.3. Antibiotik

Sejarah perkembangan penemuan antibiotik berawal dari penemuan oleh Fleming yang terus berkembang sampai sekarang. Sekarang ini telah ditemukan lebih dari 10.000 senyawa bahan alam yang dihasilkan dari mikroba. Tahun 1940 sampai dengan awal tahun 1950 merupakan tahun keemasan yaitu banyak ditemukan senyawa alam antibiotik yang berasal dari mikroba. Hampir semua antibakteri penting seperti tetrasiklin, sefalosporin, amiloglikosid, dan makrolida telah ditemukan pada tahun-tahun tersebut. Menurut Berdy 2005 pada tahun 1940 sekitar 10-20 antibiotik telah ditemukan, pada tahun 1950-an telah ditemukan 300-400 antibiotik, sekitar tahun 1960 ditemukan 800-1000 antibiotik, tahun 1970 telah ditemukan 2500, tahun 1980 telah ditemukan 5000, tahun 1990 telah ditemukan sekitar 10.000, dan tahun 2000 telah ditemukan sekitar 20.000 antibiotik. Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikroba, dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh mikroba lain Cross 1982. Setiap antibiotik mempunyai aktivitas penghambatan pertumbuhan hanya terhadap mikroba patogen spesifik, yang disebut spektrum penghambat. Mikroba penghasil antibiotik meliputi golongan bakteri, aktinomisetes, fungi, dan beberapa mikroba lainnya. Kurang lebih 70 antibiotik dihasilkan oleh aktinomisetes, 20 dihasilkan oleh fungi dan 10 dihasilkan oleh bakteri. Streptomyces merupakan penghasil antibiotik yang paling besar jenisnya Berdy 2005. Distribusi senyawa aktif yang telah diketemukan sampai saat ini disajikan pada Tabel 1. Pada siklus hidupnya yang normal, mikroba akan tumbuh dalam medium yang sesuai dan menghasilkan jumlah sel maksimum. Setelah itu pertumbuhannya berhenti dan memasuki fase stasioner, dan selanjutnya masuk pada fase kematian terjadi kematian sel vegetatif lisis atau pembentukan spora. Pada fase stasioner sel-sel berhenti membelah dan metabolit sekunder mulai diproduksi. Metabolit sekunder sering diproduksi dalam jumlah besar dan kebanyakan disekresikan ke dalam medium biakan Cross 1982. Sebagian besar antibotik merupakan metabolit sekunder, akan tetapi ada antibiotik merupakan metabolit primer, yaitu antibiotik yang terbentuk selama fase pertumbuhan eksponensial, misalnya antibiotik polipeptida nisin. Tabel 1 Distribusi senyawa aktif dan tidak aktif yang telah diketahui. Sumber Jenis antibiotik Senyawa aktif lainnya Total senyawa aktif Penggunaan pada manusia Senyawa tidak aktif Bakteri 2900 900 3800 10-12 3000-5000 Aktinomisetes 8700 1400 10100 100-120 5000-10000 Fungi 4900 3700 8600 30-35 2000-15000 Total 16500 6000 22500 140-160 20000-25000 Berdy, 2005 Antibiotik dan produk alami natural product yang sejenis merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh hampir semua tipe makhluk hidup,