Pemurnian dan Identifikasi Senyawa Aktif yang Dihasilkan oleh

12. a

12.b Gambar 12 Spektrum 1 HNMR a dan spektrum 13 CNMR b senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11. Dari hasil interpretasi spektrum LC-MS, 1 HNMR, dan 13 C NMR, diduga struktur molekul senyawa tersebut adalah seperti yang disajikan dalam Gambar 13. Gambar 13 Struktur molekul senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 Dua singlet atom karbon yang merupakan atom karbon dari gugus keton pada δ C 170,8 sC1 dan δ C 166,9 s C4 Gambar 12b. Analisis lebih lanjut dari spektrum 13 C, dua atom karbon yang tidak tersubstitusi ditunjukkan pada δ C 127,7 C1’ dan 157,7 C4’. Enam karbon methine ditunjukkan pada δ C 57,9 C3, 60,1 C6, 132,1 C2’, 116,3 C3’, 116,2 C5’, 132,1 C6’, dan empat karbon methylene ditunjukkan pada δ C 29,4 C7, 22,5 C8, 45,9 C9, 37,7 C10. DEPT 135° dan 90° Gambar 14 menunjukkan ada enam karbon methine [ δ C 57,9 C3, 60,1 C6, 132,1 C2’, 116,3 C3’, 116,2 C5’, 132,1 C6’] dan empat karbon methylene [ δ C 29,4 C7, 22,5 C8, 45,9 C9, 37,7 C10 ]. Dari spektrum DEPT 13 C NMR terlihat puncak C6’ tumpang tindih dengan C2’ dan C3’ tumpang tindih dengan C5’. Hal ini disebabkan posisi C6’ simetri dengan C2’ dan C3’ simetri dengan C5’ yang mendapatkan pengaruh atau gugus tetangga dan awan elektron yang sama besar. Apabila dilihat dari geseran kimianya, proton pada posisi C3’ dan C5’ lebih upfield dibandingkan dengan proton pada posisi C2’ and C6’, hal ini disebabkan karena efek lindungan shielding effect dari gugus hidroksi pada posisi C4’ dan membentuk posisi ortho dengan atom C3’ and C5’. Hal yang sama terjadi pada C1’ posisi para dengan C4’ yang tergeser lebih upfield dibandingkan C2’ dan C6’. Gambar 14 Spektrum DEPT 13 C NMR senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11 Hasil analisis menggunakan spektrum infra merah Gambar 15, pita karakteristik senyawa ini ditunjukkan pada 3383 cm -1 N-H, 3227 cm -1 O-H, 2959 cm -1 saturated C-H, 1660 cm -1 C=O, 1515 cm -1 cincin benzen, 1456 cm -1 methine, 1344 cm -1 methylene, 1232 cm -1 fenol, 1116 cm -1 C-O, 827 cm -1 p-disubstituted benzene ring. Pola spektrum infra merah ini sangat mirip dengan senyawa siklotirosil-prolil yang telah ditemukan sebelumnya oleh Milne et al. 1992. Informasi yang diperoleh dari spectrum infra merah menguatkan bahwa senyawa aktif yang diperoleh adalah siklotirosil-prolil. Identifikasi dilanjutkan pada uji titik leleh menggunakan Gallen Kamp Melting Point Bicasa. Hasil uji menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11 memiliki titik leleh sebesar 140 °C. Gambar 15 Spektrum inframerah senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11 Data spektrum infra merah yang menunjukkan gugus fungsional yang terdapat dalam senyawa tersebut memperkuat data 13 C NMR dan 1 H NMR. Data kombinasi spektrum 13 C NMR dan 1 H NMR yang menunjukkan posisi atom C dan atom H pada gugus fungsional yang ditunjukkan oleh spektrum Infra Red disajikan dalam Tabel 8. Senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 termasuk dalam kelompok siklodipeptida dengan nama siklotirosil-prolil. Siklotirosil-prolil juga dihasilkan oleh Alternaria alternate yang digunakan sebagai host-specific phytotoxin untuk tumbuhan spotted knapweed Stierle et al.1988 dan dihasilkan juga oleh Pseudomonas fluorescens GcM5-1A yang diisolasi dari pine wood nematode PWN, Bursaphelenchus xylophilus Guo et al. 2007. Menurut Graz et al. 2000 disamping memiliki aktivitas antibakteri, siklotirosil-prolil adalah senyawa yang dapat digunakan untuk mengiduksi pematangan dalam terapi sel kanker, disamping itu menurut Graz et al.1999 siklotirosil-prolil juga memiliki aktivitas dalam pematangan sel gastrointestinal. Apabila dibandingkan dengan sebelum diperoleh isolat A11 dari Pantai Anyer Banten, penelitian ini telah mampu memberikan nilai tambah terhadap isolat-isolat mikroba laut yang belum sepenuhnya dimanfaatkan. Dengan ditemukannya senyawa aktif siklotirosil-prolil yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11 maka ada nilai tambah yang diperoleh dari pemanfaatan isolat ini. Siklotirosil-prolil memiliki nilai ekonomis yang tinggi, dari daftar harga Chem-info di dalam http:www.chem-info.comtradesellCyclo-Pro- Tyr-518590.html menunjukkan bahwa harga siklotirosil-prolil murni sebesar US 155 per gramnya. Dengan demikian senyawa ini memiliki potensi untuk dikembangkan dan diproduksi. Tabel 8 Data spektrum 13 C NMR dan 1 H NMR yang menunjukkan posisi atom C dan H pada gugus fungsionalnya No δ 13 C ppm δ 1 H ppm dalam MeOD Gugus fungsional 1 170,8 s C O N R 2 3 57,9 d 4,4 t CH 4 166,9 s C O N R 5 6 60,1 d 4,0dd CH 7 29,4 t 2,1 m -CH 2 - 8 22,5 t 1,8 m -CH 2 - 9 45,9 t 3,5 dd CH 2 N 10 37,7 t 3,1 dd -CH 2 - 1’ 127,7 s C R 2’ 132,1 d 7,0 d =CH- 3’ 116,3 d 6,7 d =CH- 4’ 157,7 s C OH 5’ 116,3 d 6,7 d =CH- 6’ 132,1 d 7,0 d =CH-

IV.5. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration MIC Senyawa Aktif

Siklotirosil-prolil Minimum Inhibitory Concentration MIC merupakan salah satu metode untuk menentukan daya hambat suatu senyawa tertentu terhadap mikroba uji. MIC banyak digunakan untuk menguji aktivitas secara in vitro suatu senyawa aktif yang memiliki aktivitas antimikroba Andrews 2001. Pada penelitian ini MIC ditentukan mengikuti metode Bonev et al. 2008 dan Andrews 2001 yang dimodifikasi yaitu dengan cara melarutkan senyawa antibiotik hasil purifikasi dalam beberapa konsentrasi yaitu dari konsentrasi 6500 μg mL -1 sampai dengan 50,5 μg mL -1 . Masing-masing konsentrasi diuji aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji menggunakan metode difusi agar. Titik potong sumbu Y pada X=0 dalam kurva yang dibentuk Log [C] konsentrasi sebagai sumbu Y melawan X 2 diameter zona bening sebagai sumbu X merupakan nilai logaritma MIC, dengan demikian besarnya MIC dapat ditentukan. Hasil penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap 4 bakteri uji disajikan dalam Tabel 9, sedangkan kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap 4 bakteri uji disajikan dalam Lampiran 7. Tabel 9 Minimum Inhibitory Concentration MIC siklotirosil-prolil Konsentrasi hambatan minimum MIC µg mL -1 Sampel Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bacillus subtilis ATCC 66923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Senyawa hasil pemurnian 27 80 74 69 Tetrasiklin senyawa pembanding 64 256 128 13 Tabel 9 menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi memiliki daya hambat yang kuat melawan bakteri Gram-positif maupun Gram-negatif. Terhadap Escherichia coli ATCC 25922 yang merupakan kelompok bakteri Gram-negatif, senyawa ini menunjukkan MIC sebesar 27 µg mL -1 , demikian juga dengan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 menunjukkan MIC sebesar 69 µg mL -1 . Apabila dibandingkan dengan tetrasiklin kontrol, senyawa hasil isolasi memiliki daya hambat lebih tinggi terhadap Escherichia coli ATCC 25922, namun daya hambatnya lebih rendah terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785. Senyawa hasil isolasi juga memiliki hambatan yang kuat terhadap bakteri Gram- positif walaupun hambatannya tidak sekuat Escherichia coli ATCC 25922. Terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang merupakan kelompok bakteri Gram-positif, senyawa hasil isolasi memiliki MIC sebesar 80 µg mL -1 dan terhadap Bacillus subtilis ATCC 66923 memiliki MIC sebesar 74 µg mL -1 . Dibandingkan dengan tetrasiklin, senyawa ini masih lebih tinggi daya hambatnya terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Bacillus subtilis ATCC 6692. Menurut Tanaka 2001 dan Rhee 2004 sebagian besar antibiotik golongan peptida dikenal memiliki daya hambat yang kuat terhadap bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Menurut Rhee 2004 cycloleu-pro memiliki MIC sebesar 16 µg mL -1 terhadap Escherichia coli, MIC 32 µg mL -1 terhadap Bacillus subtilis , MIC 32 µg mL -1 terhadap Pseudomonas aeruginosa, 64 µg mL -1 terhadap Staphylococcus aureus. Selain memiliki aktivitas antibakteri, siklik dipeptida juga memiliki aktivitas sebagai anti virus, dan antitumor. Campuran beberapa siklik dipeptida memiliki efek sinergi terhadap bakteri dan fungi Rhee 2004.

IV.6. Penentuan Kurva Pertumbuhan Vegetatif Isolat Streptomyces sp.A11

Sebelum dilakukan optimasi proses fermentasi, terlebih dahulu dilakukan penentuan kurva pertumbuhan vegetatif isolat Streptomyces sp.A11 yang digunakan sebagai inokulan dalam proses optimasi fermentasi. Kurva pertumbuhan vegetatif digunakan untuk menentukan waktu yang paling tepat untuk transfer dari kultur vegetatif ke kultur fermentatif, yaitu pada saat mendekati akhir dari fase logaritma. Kultur vegetatif bertujuan untuk memperbanyak sel yang akan digunakan sebagai inokulum pada proses fermentasi. Medium yang digunakan biasanya didesain untuk perbanyakan sel. Pada penelitian ini medium yang digunakan untuk penentuan kurva vegetatif adalah medium khamir ekstrak malt ekstrak YEME. Medium YEME banyak digunakan untuk perbanyakan sel dalam kultur cair Streptomyces Daza et al. 1989. Kurva dan data pertumbuhan vegetatif Streptomyces sp.A11 berturut- turut disajikan dalam Gambar 16 dan Lampiran 8. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 10 20 30 40 50 60 70 Waktu Jam B io m a ssa se l g L -1 , g u la g L -1 , p H biomassa gula pH Gambar 16 Kurva pertumbuhan vegetatif Streptomyces sp.A11 Gambar 16 menunjukkan bahwa fase penyesuaian atau fase lag terjadi selama kurang lebih 8 jam. Pada fase lag, mikroba mulai menyesuaikan kondisi dan medium fermentasi. Pada fase ini belum terjadi pertumbuhan sel atau laju pertumbuhan sel sama dengan nol. Setelah fase lag selesai selanjutnya masuk pada fase pertumbuhan. Fase pertumbuhan atau logaritma terjadi pada rentang waktu jam ke-8 sampai dengan jam ke-50. Pada fase ini terlihat juga konsumsi gula dan pertumbuhan sel yang cepat yang diikuti penurunan pH dalam cairan medium. Konsumsi gula oleh mikroba mengakibatkan terbentuknya asam-asam organik hasil hidrolisis gula yang dapat menurunkan derajat keasaman medium Sanchez et al. 2010. Apabila dilihat dari rentang waktu fase logaritma maka proses pemanenan sel vegetatif untuk inokulum pada proses fermentasi dilakukan pada jam ke-40 sampai dengan jam ke-50, yaitu rentang waktu akhir fase pertumbuhan.

IV.7. Penentuan Profil Fermentasi Isolat Streptomyces sp. A11

Setiap mikroba memiliki profil fermentasi yang khas. Perubahan pH medium, konsumsi gula, nitrogen, biomass dapat menggambarkan kondisi fermentasi mikroba tersebut. Profil fermentasi diamati dari beberapa variabel fermentasi seperti perubahan konsentrasi gula, nitrogen total, pH, biomassa, dan