12. a
12.b
Gambar 12 Spektrum
1
HNMR a dan spektrum
13
CNMR b senyawa aktif
yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11.
Dari hasil interpretasi spektrum LC-MS,
1
HNMR, dan
13
C NMR, diduga struktur molekul senyawa tersebut adalah seperti yang disajikan dalam Gambar
13.
Gambar 13 Struktur molekul senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11
Dua singlet atom karbon yang merupakan atom karbon dari gugus keton pada
δ
C
170,8 sC1 dan δ
C
166,9 s C4 Gambar 12b. Analisis lebih lanjut dari spektrum
13
C, dua atom karbon yang tidak tersubstitusi ditunjukkan pada δ
C
127,7 C1’ dan 157,7 C4’. Enam karbon methine ditunjukkan pada δ
C
57,9 C3, 60,1 C6, 132,1 C2’, 116,3 C3’, 116,2 C5’, 132,1 C6’, dan empat
karbon methylene ditunjukkan pada δ
C
29,4 C7, 22,5 C8, 45,9 C9, 37,7 C10.
DEPT 135° dan 90° Gambar 14 menunjukkan ada enam karbon methine
[ δ
C
57,9 C3, 60,1 C6, 132,1 C2’, 116,3 C3’, 116,2 C5’, 132,1 C6’] dan empat karbon methylene [
δ
C
29,4 C7, 22,5 C8, 45,9 C9, 37,7 C10 ]. Dari
spektrum DEPT
13
C NMR terlihat puncak C6’ tumpang tindih dengan C2’ dan C3’ tumpang tindih dengan C5’. Hal ini disebabkan posisi C6’ simetri
dengan C2’ dan C3’ simetri dengan C5’ yang mendapatkan pengaruh atau gugus tetangga dan awan elektron yang sama besar.
Apabila dilihat dari geseran kimianya, proton pada posisi C3’ dan C5’ lebih upfield
dibandingkan dengan proton pada posisi C2’ and C6’, hal ini disebabkan karena efek lindungan shielding effect dari gugus hidroksi pada posisi C4’ dan
membentuk posisi ortho dengan atom C3’ and C5’. Hal yang sama terjadi pada C1’ posisi para dengan C4’ yang tergeser lebih upfield dibandingkan C2’ dan
C6’.
Gambar 14 Spektrum DEPT
13
C NMR
senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces
sp.A11 Hasil analisis menggunakan spektrum infra merah Gambar 15, pita
karakteristik senyawa ini ditunjukkan pada 3383 cm
-1
N-H, 3227 cm
-1
O-H, 2959 cm
-1
saturated C-H, 1660 cm
-1
C=O, 1515 cm
-1
cincin benzen, 1456 cm
-1
methine, 1344 cm
-1
methylene, 1232 cm
-1
fenol, 1116 cm
-1
C-O, 827 cm
-1
p-disubstituted benzene ring. Pola spektrum infra merah ini sangat mirip dengan senyawa siklotirosil-prolil yang telah ditemukan sebelumnya oleh Milne
et al. 1992. Informasi yang diperoleh dari spectrum infra merah menguatkan
bahwa senyawa aktif yang diperoleh adalah siklotirosil-prolil. Identifikasi dilanjutkan pada uji titik leleh menggunakan Gallen Kamp Melting Point Bicasa.
Hasil uji menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp A11 memiliki titik leleh sebesar 140 °C.
Gambar 15 Spektrum inframerah senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces
sp.A11 Data spektrum infra merah yang menunjukkan gugus fungsional yang
terdapat dalam senyawa tersebut memperkuat data
13
C NMR dan
1
H NMR. Data kombinasi spektrum
13
C NMR dan
1
H NMR yang menunjukkan posisi atom C dan atom H pada gugus fungsional yang ditunjukkan oleh spektrum Infra Red
disajikan dalam Tabel 8. Senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 termasuk dalam kelompok
siklodipeptida dengan nama siklotirosil-prolil. Siklotirosil-prolil juga dihasilkan oleh Alternaria alternate yang digunakan sebagai host-specific
phytotoxin untuk tumbuhan spotted knapweed Stierle et al.1988 dan dihasilkan
juga oleh Pseudomonas fluorescens GcM5-1A yang diisolasi dari pine wood nematode
PWN, Bursaphelenchus xylophilus Guo et al. 2007. Menurut Graz et al.
2000 disamping memiliki aktivitas antibakteri, siklotirosil-prolil adalah senyawa yang dapat digunakan untuk mengiduksi pematangan dalam terapi sel
kanker, disamping itu menurut Graz et al.1999 siklotirosil-prolil juga memiliki aktivitas dalam pematangan sel gastrointestinal.
Apabila dibandingkan dengan sebelum diperoleh isolat A11 dari Pantai Anyer Banten, penelitian ini telah mampu memberikan nilai tambah terhadap
isolat-isolat mikroba laut yang belum sepenuhnya dimanfaatkan. Dengan ditemukannya senyawa aktif siklotirosil-prolil yang dihasilkan oleh isolat
Streptomyces sp.A11 maka ada nilai tambah yang diperoleh dari pemanfaatan
isolat ini. Siklotirosil-prolil memiliki nilai ekonomis yang tinggi, dari daftar harga Chem-info di dalam http:www.chem-info.comtradesellCyclo-Pro-
Tyr-518590.html menunjukkan bahwa harga siklotirosil-prolil murni sebesar US 155 per gramnya. Dengan demikian senyawa ini memiliki potensi untuk
dikembangkan dan diproduksi. Tabel 8 Data spektrum
13
C NMR dan
1
H NMR yang menunjukkan posisi atom C dan H pada gugus fungsionalnya
No δ
13
C ppm δ
1
H ppm dalam MeOD
Gugus fungsional
1 170,8 s
C O
N R
2 3
57,9 d 4,4 t
CH
4 166,9 s
C O
N R
5 6 60,1
d 4,0dd
CH
7 29,4 t
2,1 m -CH
2
- 8
22,5 t 1,8 m
-CH
2
- 9
45,9 t 3,5 dd
CH
2
N 10
37,7 t 3,1 dd
-CH
2
- 1’ 127,7
s
C
R 2’
132,1 d 7,0 d
=CH- 3’
116,3 d 6,7 d
=CH- 4’ 157,7
s
C
OH 5’
116,3 d 6,7 d
=CH- 6’
132,1 d 7,0 d
=CH-
IV.5. Penentuan Minimum Inhibitory Concentration MIC Senyawa Aktif
Siklotirosil-prolil
Minimum Inhibitory Concentration MIC merupakan salah satu metode
untuk menentukan daya hambat suatu senyawa tertentu terhadap mikroba uji. MIC banyak digunakan untuk menguji aktivitas secara in vitro suatu senyawa aktif
yang memiliki aktivitas antimikroba Andrews 2001. Pada penelitian ini MIC ditentukan mengikuti metode Bonev et al. 2008 dan Andrews 2001 yang
dimodifikasi yaitu dengan cara melarutkan senyawa antibiotik hasil purifikasi dalam beberapa konsentrasi yaitu dari konsentrasi 6500
μg mL
-1
sampai dengan 50,5
μg mL
-1
. Masing-masing konsentrasi diuji aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji menggunakan metode difusi agar. Titik potong sumbu Y pada X=0
dalam kurva yang dibentuk Log [C] konsentrasi sebagai sumbu Y melawan X
2
diameter zona bening sebagai sumbu X merupakan nilai logaritma MIC, dengan demikian besarnya MIC dapat ditentukan. Hasil penentuan MIC senyawa aktif
siklotirosil-prolil terhadap 4 bakteri uji disajikan dalam Tabel 9, sedangkan kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap 4 bakteri uji
disajikan dalam Lampiran 7. Tabel 9 Minimum Inhibitory Concentration MIC siklotirosil-prolil
Konsentrasi hambatan minimum MIC µg mL
-1
Sampel Escherichia coli
ATCC 25922 Staphylococcus
aureus ATCC
25923 Bacillus
subtilis ATCC
66923 Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853
Senyawa hasil pemurnian
27 80 74
69 Tetrasiklin
senyawa pembanding
64 256 128
13
Tabel 9 menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi memiliki daya hambat yang kuat melawan bakteri Gram-positif maupun Gram-negatif. Terhadap
Escherichia coli ATCC 25922 yang merupakan kelompok bakteri Gram-negatif,
senyawa ini menunjukkan MIC sebesar 27 µg mL
-1
, demikian juga dengan Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 menunjukkan MIC sebesar 69 µg mL
-1
. Apabila dibandingkan dengan tetrasiklin kontrol, senyawa hasil isolasi memiliki
daya hambat lebih tinggi terhadap Escherichia coli ATCC 25922, namun daya hambatnya lebih rendah terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC 2785.
Senyawa hasil isolasi juga memiliki hambatan yang kuat terhadap bakteri Gram- positif walaupun hambatannya tidak sekuat Escherichia coli ATCC 25922.
Terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 yang merupakan kelompok bakteri Gram-positif, senyawa hasil isolasi memiliki MIC sebesar 80 µg mL
-1
dan
terhadap Bacillus subtilis ATCC 66923 memiliki MIC sebesar 74 µg mL
-1
. Dibandingkan dengan tetrasiklin, senyawa ini masih lebih tinggi daya hambatnya
terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Bacillus subtilis ATCC 6692. Menurut Tanaka 2001 dan Rhee 2004 sebagian besar antibiotik golongan
peptida dikenal memiliki daya hambat yang kuat terhadap bakteri Gram-positif dan bakteri Gram-negatif. Menurut Rhee 2004 cycloleu-pro memiliki MIC
sebesar 16 µg mL
-1
terhadap Escherichia coli, MIC 32 µg mL
-1
terhadap Bacillus subtilis
, MIC 32 µg mL
-1
terhadap Pseudomonas aeruginosa, 64 µg mL
-1
terhadap Staphylococcus aureus. Selain memiliki aktivitas antibakteri, siklik dipeptida juga memiliki aktivitas sebagai anti virus, dan antitumor. Campuran
beberapa siklik dipeptida memiliki efek sinergi terhadap bakteri dan fungi Rhee 2004.
IV.6. Penentuan Kurva Pertumbuhan Vegetatif Isolat Streptomyces sp.A11
Sebelum dilakukan optimasi proses fermentasi, terlebih dahulu dilakukan penentuan kurva pertumbuhan vegetatif isolat Streptomyces sp.A11 yang
digunakan sebagai inokulan dalam proses optimasi fermentasi. Kurva pertumbuhan vegetatif digunakan untuk menentukan waktu yang paling tepat
untuk transfer dari kultur vegetatif ke kultur fermentatif, yaitu pada saat mendekati akhir dari fase logaritma. Kultur vegetatif bertujuan untuk
memperbanyak sel yang akan digunakan sebagai inokulum pada proses fermentasi. Medium yang digunakan biasanya didesain untuk perbanyakan sel.
Pada penelitian ini medium yang digunakan untuk penentuan kurva vegetatif adalah medium khamir ekstrak malt ekstrak YEME. Medium YEME banyak
digunakan untuk perbanyakan sel dalam kultur cair Streptomyces Daza et al.
1989. Kurva dan data pertumbuhan vegetatif Streptomyces sp.A11 berturut- turut disajikan dalam Gambar 16 dan Lampiran 8.
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11
10 20
30 40
50 60
70
Waktu Jam B
io m
a ssa
se l
g L
-1
, g
u la
g L
-1
, p
H
biomassa gula
pH
Gambar 16 Kurva pertumbuhan vegetatif Streptomyces sp.A11 Gambar 16 menunjukkan bahwa fase penyesuaian atau fase lag terjadi
selama kurang lebih 8 jam. Pada fase lag, mikroba mulai menyesuaikan kondisi dan medium fermentasi. Pada fase ini belum terjadi pertumbuhan sel atau laju
pertumbuhan sel sama dengan nol. Setelah fase lag selesai selanjutnya masuk pada fase pertumbuhan. Fase pertumbuhan atau logaritma terjadi pada rentang
waktu jam ke-8 sampai dengan jam ke-50. Pada fase ini terlihat juga konsumsi gula dan pertumbuhan sel yang cepat yang diikuti penurunan pH dalam cairan
medium. Konsumsi gula oleh mikroba mengakibatkan terbentuknya asam-asam organik hasil hidrolisis gula yang dapat menurunkan derajat keasaman medium
Sanchez et al. 2010. Apabila dilihat dari rentang waktu fase logaritma maka proses pemanenan sel vegetatif untuk inokulum pada proses fermentasi dilakukan
pada jam ke-40 sampai dengan jam ke-50, yaitu rentang waktu akhir fase pertumbuhan.
IV.7. Penentuan Profil Fermentasi Isolat Streptomyces sp. A11
Setiap mikroba memiliki profil fermentasi yang khas. Perubahan pH medium, konsumsi gula, nitrogen, biomass dapat menggambarkan kondisi
fermentasi mikroba tersebut. Profil fermentasi diamati dari beberapa variabel fermentasi seperti perubahan konsentrasi gula, nitrogen total, pH, biomassa, dan