9. Penentuan Sumber Karbon Terbaik pada Proses Fermentasi

Hasil percobaan diperoleh informasi bahwa sumber karbon terbaik untuk produksi senyawa aktif siklotirosil-prolil dihasilkan oleh dekstrin dan maltosa Gambar 21. 5 10 15 20 25 30 laktosa glukosa molase sukrosa dekstrin maltosa sumber karbon k o n s e n tr a s i s ik lo t ir o s il -p ro lil mg L -1 Gambar 21 Pengaruh sumber karbon terhadap konsentrasi siklotirosil- prolil Hasil analisis ragam Lampiran 13a menunjukkan bahwa perlakuan terhadap beberapa sumber karbon berpengaruh nyata terhadap konsentrasi antibiotik yang dihasilkannya. Dari Gambar 21 terlihat bahwa sumber karbon dekstrin menghasilkan konsentrasi antibiotik sebesar 28,41 mg L -1 dan diikuti dengan maltosa dengan konsentrasi sebesat 25,29 mg L -1 . Hasil Uji Duncan dengan taraf nyata α 0,05 menunjukkan bahwa konsentrasi antibiotik yang dihasilkan oleh kedua sumber karbon dekstrin dan maltosa tidak berbeda nyata. Apabila dilihat dari konsentrasi antibiotik dan rasio konsentrasi antibiotik terhadap konsumsi sumber karbon Tabel 10 terlihat bahwa dektrin menunjukkan sumber karbon yang terbaik. Konsumsi dekstrin terlihat lebih sedikit dibandingkan dengan glukosa maupun maltosa, namun demikian konsentrasi antibiotik yang dihasilkan lebih besar, artinya bahwa konversi sumber karbon menjadi metabolit sekunder adalah lebih besar Tabel 10. Hal yang sama ditunjukkan pada rasio konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkan terhadap total konsumsi sumber karbon, terlihat dekstrin menunjukkan rasio yang paling tinggi. Berbeda halnya dengan glukosa, konsumsi glukosa cenderung besar, namun demikian konsentrasi antibiotik yang dihasilkan cenderung lebih kecil dibandingkan dekstrin. Menurut Wang 1979 sebagian besar mikroba lebih menyukai glukosa yang dapat dimetabolisme secara langsung dibandingkan sumber karbon lainnya. Konsumsi glukosa pada fase logaritma diiringi pertumbuhan sel yang cepat, sehingga jumlah sel cenderung meningkat lebih cepat. Data selengkapnya disajikan dalam Lampiran 13b. Tabel 10 Konsentrasi antibiotik yang dihasilkan adanya perlakuan sumber karbon Sumber karbon Konsentrasi siklo tirosil- prolil mg L -1 Notasi Total konsumsi sumber karbon mg So-SSo x 100 Rasio konsentrasi siklo tirosil-prolil terhadap total konsumsi sumber karbon Yps Laktosa 12,84 a 4034 32,26 0,00318 Sukrosa 14,05 a 4401 47,87 0,00319 Molase 15,50 a 4933 83,47 0,00314 Glukosa 23,00 bc 9747 86,05 0,00224 Maltosa 25,29 cd 9409 79,45 0,00269 Dekstrin 28,41 d 8573 78,08 0,00331 Total konsumsi sumber karbon : konsentrasi sumber karbon awal sebelum fermentasi dikurangi konsentrasi sumber karbon setelah fermentasi Tabel 10 menunjukkan konsumsi glukosa lebih tinggi dibandingkan dengan konsumsi maltosa dan dektrin. Pada awal fermentasi dan fase logaritma, konsumsi glukosa lebih banyak digunakan untuk pembentukan sel. Menurut Stanbury dan Whitaker 1984 adanya glukosa dalam medium fermentasi dapat menyebabkan terjadinya metabolisme cepat fast metabolism untuk pembentukan sel dan secara bersamaan akan merepresi reaksi enzim pembentukan metabolit sekunder. Namun demikian apabila konsentrasi glukosa mulai terbatas, pembentukan metabolit sekunder akan terjadi. Untuk dapat menggunakan substrat maltosa atau dektrin masuk kedalam sel, diperlukan pemecahan atau hidrolisis maltosa atau dekstrin menjadi glukosa terlebih dahulu. Gambar 20 menunjukkan lintasan metabolisme maltosa dapat melalui glukosa yang dilanjutkan dengan glikolisis menjadi glukosa-6-fosfat dan melalui lintasan melalui konversi maltosa menjadi glukosa-1-fosfat yang berlanjut menjadi glukosa-6-fosfat. Lintasan metabolisme dektrin menjadi lebih panjang, yaitu melalui pemecahan dektrin menjadi maltosa dan glukosa, dan tahap selanjutnya mengikuti lintasan metabolisme glukosa dan maltosa. Perbedaan lintasan metabolisme menyebabkan laju penggunaan substrat antara glukosa, maltosa, dan dekstrin menjadi berbeda. Perbedaan lintasan metabolisme juga berpengaruh terhadap besarnya energi, dalam hal ini ATP yang diperlukan atau dibebaskan dalam proses anabolisme dan katabolisme. Konsumsi sumber karbon laktosa, sukrosa, dan molase terlihat jauh lebih kecil dibandingkan sumber karbon glukosa, maltosa, dan dekstrin, demikian juga konsentrasi antibiotik yang dihasilkan. Hal ini menunjukkan bahwa isolat Streptomyces sp.A11 kurang mampu menghidrolisis dan mengkonsumsi sumber karbon tersebut. Untuk dapat digunakan dalam metabolisme sel, laktosa terlebih dahulu dihidrolisis menjadi glukosa dan galaktosa. Enzim yang terlibat dalam proses hidrolisis laktosa adalah enzim β-galaktosidase. Kurangnya kemampuan dalam mengasimilasi laktosa ditandai dengan pertumbuhan sel yang lambat. Hal yang sama terjadi pada konsumsi sukrosa. Sukrosa merupakan disakarida yang disusun dari glukosa dan fruktosa. Sebelum dapat diasimilasi oleh mikroba, sukrosa terlebih dahulu dihidrolisis menggunakan enzim invertase. Tidak semua mikroba memiliki kemampuan untuk menghidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Adapun reaksi hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa disajikan sebagai berikut: C 22 H 22 O 11 + H 2 O C 6 H 12 O 6 + C 6 H 12 O 6 invertase Glukosa Fruktosa Sukrosa Penggunaan molase sebagai sumber karbon pada percobaan ini diperoleh konsentrasi siklotirosil-prolil yang lebih rendah dibandingkan dengan penggunaan sumber karbon glukosa, maltosa, dan dektrin. Molase merupakan hasil samping dari proses produksi gula. Disamping kaya akan sukrosa, fruktosa, dan glukosa, molase juga mengandung bermacam-macam mineral. Namun demikian karena molase merupakan hasil samping yang sebelumnya dilakukan penambahan bahan kimia dalam proses produksi gula, sulit untuk memprediksi komposisi kimia sebenarnya yang terkandung di dalam molase. Banyak kemungkinan unsur-unsur logam yang terkandung didalamnya menghambat atau mempercepat pertumbuhan mikroba. Molase yang digunakan dalam penelitian ini menghasilkan pertumbuhan isolat Streptomyces sp. A11 yang lambat, demikian juga dengan konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkannya. Kompleksitas komposisi molase menjadi lebih sulit untuk memprediksi kemungkinan penyebab kecilnya laju pertumbuhan dan produktivitas siklotirosil-prolil. Dalam penggunaan sumber karbon komplek seperti halnya molase, maka perlu diperhatikan regulasi penggunaan sumber karbon dalam sel. Menurut Sanchez et al . 2010 salah satu faktor yang berpengaruh dalam proses fermentasi adalah regulasi sumber karbon dalam metabolisme sel. Regulasi sumber karbon ditentukan oleh kecepatan penggunaan sumber karbon yang paling disukai oleh mikroba tersebut. Salah satu faktor regulasi sumber karbon yang paling penting adalah represi katabolit sumber karbon. Mikroba akan menentukan sumber karbon yang paling disukai untuk dimetabolisme terlebih dahulu dibandingkan sumber karbon lainnya dengan melakukan represi reaksi enzim tertentu yang terjadi di dalam metabolisme tersebut Martin dan Demain 1980. Dalam jalur metabolisme, dektrin dan maltosa dihidolisis menjadi glukosa, dan berlanjut sampai terjadinya glikolisis menjadi piruvat. Walaupun jalur metabolisme yang digunakan oleh dekstrin dan maltosa pada akhirnya mirip dengan lintasan glukosa, namun produktivitas siklotirosil-prolil dengan sumber karbon dekstrin dan maltosa lebih tinggi dibandingkan dengan sumber karbon glukosa. Glukosa merupakan sumber karbon yang siap dimetabolisme secara langsung tanpa dilakukan hidrolisis seperti halnya dektrin atau polisakarida lainnya. Mikroba akan merasa nyaman dan terus tumbuh dengan adanya glukosa dalam jumlah yang cukup. Pada Tabel 10 terlihat bahwa konsumsi glukosa terlihat relatif lebih banyak dibandingkan maltosa dan dekstrin. Berbeda halnya dengan sumber karbon dekstrin dan maltosa, kedua sumber karbon ini akan mengalami hidrolisis terlebih dahulu menjadi glukosa untuk dapat digunakan dalam proses metabolisme sel. Dengan demikian jumlah glukosa yang dibutuhkan untuk pertumbuhan sel dapat diatur dengan sendirinya oleh mikroba tersebut. Hal yang sama terjadi pada produksi aktinomisin D menggunakan isolat Streptomyces parvulus Sausa et al. 2001. Penggunaan glukosa dalam medium fermentasi mengakibatkan pertumbuhan sel yang cepat dan produktivitas aktinomisin D menjadi berkurang. Streptomyces merupakan salah satu bakteri Gram-positif non-motil yang memiliki kemampuan menghidrolisis berbagai sumber karbon polimer yang ada di lingkungan. Streptomyces memiliki jumlah protein enzim yang paling lengkap yang dapat mendukung kemampuannya untuk dapat bertahan hidup di lingkungannya. Sebagai contoh Streptomyces coelicolor memiliki 614 protein untuk mendukung kelangsungan hidupnya Sanchez et al. 2010. Berdasarkan hasil percobaan pendahuluan yang telah dilakukan sebelumnya, maka sumber karbon dekstrin dipilih sebagai sumber karbon untuk penelitian selanjutnya. Dekstrin merupakan salah satu produk hasil hidrolisis parsial pati yang memiliki unit rantai glukosa yang pendek 6 – 10 molekul glukosa sehingga dektrin memiliki sifat lebih mudah larut di dalam air. Dektrin juga menjadi sumber karbon terbaik untuk produksi antibiotik spiramycin oleh Streptomyces ambofaciens Benslimane et al.1995; Ashy dan Abou-Zeid 1982.

IV. 10. Penentuan Sumber Nitrogen Terbaik pada Proses Fermentasi

Salah satu komponen utama dalam medium fermentasi mikroba disamping sumber karbon adalah sumber nitrogen. Nitrogen digunakan sebagai sumber sintesis asam amino, purin, piridin, protein, DNA dan RNA Vogel 1996. Sumber nitrogen juga berperan penting dalam pembentukan biomassa sel pada fase pertumbuhan, disamping itu sumber nitrogen juga berperan penting dalam pembentukan metabolit sekunder khususnya antibiotik golongan peptida Umezawa et al. 1978. Disamping konsentrasi sumber nitrogen dalam medium fermentasi, jenis sumber nitrogen juga berpengaruh terhadap produktifitas metabolit primer atau sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Sumber nitrogen komplek organik banyak digunakan dalam produksi metabolit sekunder antibiotik dibandingkan dengan sumber nitrogen inorganik seperti nitrat, nitrit, dan ammonium sulfat Aharonowitz 1980. Dengan demikian pemilihan jenis sumber nitrogen berperan penting dalam proses produksi metabolit primer atau sekunder. Sumber nitrogen yang digunakan dalam percobaan ini meliputi sumber nitrogen kompleks seperti pepton, ekstrak khamir, kasein hidrolisat dan sumber nitrogen non kompleks seperti asam glutamat dan ammonium sulfat. Hasil percobaan pemilihan sumber nitrogen terbaik menunjukkan bahwa pepton terlihat menghasilkan konsentrasi siklotirosil-prolil paling tinggi, yaitu sebesar 22,7 mg L -1 , selanjutnya kasein sebesar 21,65 mg L -1 , ekstrak khamir 12,88 mg L -1 , dan asam glutamate 9,99 mg L -1 . Sumber nitrogen ammonium sulfat terlihat tidak menghasilkan konsentrasi antibiotik. Hasil analisis ragam Lampiran 14a menunjukkan bahwa perlakuan terhadap beberapa sumber nitrogen berpengaruh nyata terhadap konsentrasi antibiotik yang dihasilkan. Namun demikian hasil Uji Duncan dengan taraf nyata α 0,05 menunjukkan bahwa konsentrasi antibiotik yang dihasilkan oleh sumber nitrogen pepton dan kasein adalah tidak berbeda nyata. Dilihat dari tingkat konsumsi nitrogen antara pepton dan kasein Tabel 11, yaitu nitrogen total awal fermentasi dikurangi nitrogen total akhir fermentasi adalah hampir sama, hal ini menunjukkan bahwa penggunakan sumber nitrogen pepton dan kasein tidak berbeda nyata. Data selengkapnya disajikan dalam Gambar 22 dan Tabel 11. 5 10 15 20 25 amonium sulfat ekstrak khamir asam glutamat kasein pepton sumber nitrogen k o n s en tr asi s ik lo ti ro s il -pr o li l m g L -1 Gambar 22 Pengaruh sumber nitrogen terhadap konsentrasi siklotirosil-prolil Dari Tabel 11 terlihat bahwa tingkat konsumsi pepton dan kasein relatif tinggi dibandingkan dengan sumber nitrogen lainnya, hal ini diimbangi juga dengan produktivitas antibiotik yang tinggi. Berbeda halnya dengan konsumsi sumber nitrogen ekstrak khamir, terlihat tingkat konsumsi ekstrak khamir tinggi namun produktivitas antibiotik relatif lebih kecil dibanding pepton dan kasein. Diduga tingginya konsumsi ekstrak khamir ini lebih banyak dikonversi menjadi biomassa dibandingkan dengan konversi menjadi siklotirosil-prolil. Tabel 11 Pengaruh perlakuan sumber nitrogen terhadap konsentrasi siklotirosil- prolil Sumber nitrogen Nitrogen total awal fermentasi mg.mL -1 Nitrogen total akhir fermentasi mg.mL -1 Konsentrasi siklotirosil- prolil mg.L -1 Jumlah konsumsi nitrogen total mg.mL -1 Asam glutamat C 5 H 9 NO 4 0,76 0,44 9,99 0,32 Pepton 0,76 0,35 22,70 0,41 Kasein 0,75 0,34 21,65 0,41 Ekstrak khamir 0,74 0,30 12,88 0,44 Amonium sulfat NH 4 2 SO 4 0,75 0,55 0 0,20 Pepton Difco merupakan produk hidrolisis dari protein hewani yang diambil dari albumin. Pepton mengandung bermacam-macam asam amino hasil hidrolisis protein hewani. Pepton banyak digunakan untuk medium sumber nitrogen kompleks dalam proses fermentasi. Sedangkan kasein Difco merupakan produk hidrolisis protein susu yang diperoleh dari kasein susu. Seperti halnya pepton, kasein juga kaya akan protein yang disusun dari beberapa macam asam amino. Kasein banyak digunakan dalam medium fermentasi atau campuran dalam medium agar. Menurut Aharonowitz 1980, keterlibatan nitrogen dalam regulasi metabolisme biosintesis antibiotik dapat dikategorikan dalam 2 jalur. Pertama, nitrogen dalam bentuk asam amino terlibat langsung dalam pembentukan antibiotik. Asam amino bertindak sebagai prekursor dalam proses pembentukan antibiotik. Proses ini banyak terjadi dalam pembentukan antibiotik golongan peptida. Sebagai contoh pada biosintesis antibiotik gramisidin oleh Bacillus sp dan Pseudomonas, dibutuhkan 5 asam amino yang terlibat langsung sebagai prekursor dalam pembentukan biosintesis gramisidin tersebut. Kedua, nitrogen dalam bentuk atom nitrogen terlibat dalam biosintesis metabolit primer dan berlanjut menjadi senyawa metabolit sekunder. Dilihat dari keterlibatan nitrogen dalam biosintesis antibiotik seperti yang dikemukaan oleh Aharonowitz 1980, diduga peran nitrogen dalam biosintesis siklotirosil-prolil mengikuti jalur yang pertama, yaitu asam amino terlibat langsung dalam biosintesis antibiotik. Hal ini dikuatkan dari penggunaan sumber nitrogen pepton dan kasein yang mengandung asam amino menghasilkan produktivitas siklotirosil-prolil yang lebih tinggi. Lautru et al. 2002 menjelaskan bahwa biosintesis siklophe-leu disusun oleh asam amino phenil alanin dengan leusin secara langsung dari asam amino, masing-masing asam amino diaktifkan oleh siklodipeptida sintetase CDPSs melalui gen AlbC. Sampai saat ini belum ada literatur yang menjelaskan mengenai biosintesis pembentukan siklotirosil-prolil. Biosintesis pembentukan siklotirosil-prolil diduga melalui jalur pengaktifan asam amino tirosin dan prolin dengan menggunakan siklodipeptida sintetase seperti yang dijelaskan oleh Lautru et al. 2002. Kemungkinan reaksi pembentukan siklotirosil-prolil terjadi adalah seperti yang disajikan dalam Gambar 23. HO O O H HN N H 2 + - H 3 + - + siklodipeptida sintetaseCDPSs prolin tirosin siklotirosil-prolil Gambar 23 Reaksi pembentukan siklotirosil-prolil Apabila dilihat dari komposisi asam amino dari sumber nitrogen pepton, kasein, dan ekstrak khamir, terlihat bahwa ketiga sumber nitrogen ini mengandung asam amino prolin dan tirosin dalam bentuk bebas dan terikat dalam protein seperti yang disajikan dalam Tabel 12. Pepton mengandung total prolin, tirosin bebas, dan total tirosin yang lebih tinggi dibandingkan kasein dan ekstrak khamir. Kasein mengandung jumlah prolin bebas, total prolin, tirosin bebas, dan total tirosin yang lebih besar dibandingkan dengan ekstrak khamir. Konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkan oleh pepton dan kasein lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak khamir. Hal ini mendukung dugaan bahwa biosintesis siklotirosil-prolil