46 tinggi, seperti C-8, C-18 atau Sep-Pak plus C-18. kolom C-18 mempunyai
interaksi hidrofobik yang lebih besar dibanding kolom C-8 karena ikatan karbonnya lebih banyak sehingga dapat memisahkan senyawa berdasarkan
kepolaran yang lebih baik.
D. Karakterisasi Sensori Fraksi hasil SPE
Uji sensori ini untuk mengetahui pengaruh fraksinasi hasil SPE terhadap karakter sensori rasa asin dan rasa gurih dari fraksi-fraksi tersebut
dan untuk mengetahui fraksi yang paling berperan terhadap rasa gurih. Intensitas rasa gurih dari ketujuh fraksi tersebut diperoleh melalui analisis
sensori yang dilakukan 8 orang panelis terlatih dengan 3 kali ulangan. Analisis ini dilakukan dengan cara membandingkan intensitas rasa gurih dari fraksi
yang diuji dengan intensitas rasa gurih dari standar. Pengujian sampel dilakukan dengan uji skoring menggunakan system
skala. Hasil uji skoring intensitas rasa gurih tanpa modifikasi atau sampel utuh menunjukkan bahwa Fraksi 1 merupakan sampel tergurih dengan skor
40.4, Kemudian diikuti Fraksi Tidak Tertahan FTT dengan skor 31.3. hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11. Hasil uji sensori terhadap rasa gurih sampel hasil SPE ekstrak ikan asin jambal roti tanpa modifikasi.
10 20
30 40
50
f1 f2
f3 f4
f5 f6
f7 ftt
fraksi sk
o r
skor gurih Skor Asin
47 Sampel yang digunakan saat fraksinasi dengan SPE merupakan sampel
fraksi satu yang bebas garam, karena fraksi garam terkumpul pada fraksi dua. Tetapi, saat diuji sensori intensitas rasa asin pada fraksi-fraksi hasil SPE
ternyata panelis masih dapat merasakan rasa asin pada sampel, seperti yang terlihat pada Gambar 11. Hal ini diduga karena timbulnya suatu rasa yang
mirip dengan rasa NaCl yang diakibatkan keberadaan peptida rasa asin dan garam-garam anorganik lain seperti LiCl dan KCl.
E. Analisis Profil Peptida dengan RP-HPLC
Fraksi-fraksi ekstrak ikan asin jambal roti yang telah di SPE selain dilakukan uji sensori, juga dilakukan analisis profil peptidanya dengan
menggunakan RP-HPLC Reverse Phase - High Performance Liquid Chromatography
. Proses pemisahan pada RP-HPLC didasarkan pada perbedaan kepolaran senyawanya. Eluen atau fase mobil yang digunakan
adalah campuran antara air bebas ion dan acetonitrile dengan sistem gradien. Eluen sebelum digunakan harus dilakukan penghilangan gas. Hal ini bertujuan
agar pada saat eluen dialirkan tidak terdapat gelembung-gelembung dalam aliran pelarut tersebut. Adanya gelembung yang masuk ke dalam kolom akan
menyebabkan aliran menjadi diskontinyu, yang seterusnya dapat mengganggu kromatogram yang terbentuk, dan menyebabkan pergeseran garis dasar
Adnan, 1997. Proses pencegahan adanya gelembung pada air cenderung lebih susah dibanding dengan acetonitrile. Hal ini dikarenakan gelembung air
cenderung menempel pada selang pemasukan eluen. Kolom yang digunakan pada RP-HPLC ini mempunyai ukuran partikel
fase stasionernya berukuran 5 µm. Ukuran partikel yang kecil ini diharapkan dapat meningkatkan efisiensi pemisahan karena luas permukaan areanya lebih
besar, sehingga interaksi antara fase stasioner, sampel dan fase mobil menjadi lebih besar pula. Detektor yang digunkan adalah detektor UV pada panjang
gelombang 214 nm, karena ikatan peptida menyerap kuat pada panjang gelombang ini.
Hasil pengujian yang diperoleh dari RP-HPLC menunjukkan bahwa peak-peak muncul pada awal running yaitu pada saat konsentrasi acetonitrile
48 masih rendah 2-4 , sedangkan kondisi running adalah Acetonitrile 2-
30 selama 30 menit. Dari hasil kromatogram tersebut senyawa-senyawa yang terdapat pada fraksi-fraksi yang dianalisis merupakan senyawa polar.
Semakin tinggi konsentrasi acetonitrile berarti semakin nonpolar fase mobil yang digunakan, dan senyawa yang terelusi juga lebih bersifat nonpolar
seiring turunnya kepolaran fase mobil. Kromatogram fraksi tidak tertahan, fraksi 1 dan fraksi 2 masih
terdapat peak yang cukup banyak, sedangkan pada kromatogram fraksi 3, 4, 5, 6 dan 7 hanya terdapat single peak. Single peak yang terdapat pada fraksi-
fraksi tersebut diduga merupakan asam amino, bukan peptida karena hanya mempunyai satu retention tim. Gambar kromatogram dari kedelapan fraksi
hasil SPE dan sampel hasil kromatografi filtrasi gel Fraksi 1 dapat dilihat pada Gambar 12 sampai 20. dan selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 14
sampai 22. Pada fraksi tidak tertahan, fraksi 1 dan 2 mempunyai peak-peak yang
cenderung bergabung, dan mempunyai kisaran retention time yang hampir sama. Pada kromatogram crude sample yaitu sampel yang menggunakan
fraksi sebelum SPE dari hasil Kromatografi filtrasi gel peak-peak yang muncul juga tidak jauh berbeda dengan peak-peak pada fraksi tidak tertahan,
fraksi 1 dan dua. Hal ini menunjukkan bahwa pemisahan menggunakan SPE kurang efektif. Penggunaan cartridge yang berulang sampai tiga kali
merupakan salah satu faktor penyebab kekurang efektifan tersebut. Disamping itu, proses elusi yang kurang sempurna juga bisa menyebabkan elusi senyawa
sampel antar fraksi jadi bias karena kemungkinan tertahan oleh kolom pada fraksi sebelumnya.
1 Gambar 12. Kromatogram Fraksi 1 hasil SPE
2 Gambar 13. Kromatogram Fraksi 2 hasil SPE
3 Gambar 14. Kromatogram Fraksi 3 hasil SPE
4 Gambar 15. Kromatogram Fraksi 4 hasil SPE
5 Gambar 16. Kromatogram Fraksi 5 hasil SPE
6 Gambar 17. Kromatogram Fraksi 6 hasil SPE
7 Gambar 18. Kromatogram Fraksi 7 hasil SPE
8 Gambar 19. Kromatogram Fraksi Tidak Tertahan FTT hasil SPE
53 Analisa profil peptida sampel fraksi-fraksi hasil SPE dengan RP-HPLC
dilakukan dengan membandingkan profil kromatogram dari sampel dengan Retention Time
dari standar asam amino. Retention Time beberapa asam amino standar dapat dilihat pada Tabel 4. Dan kromatogram selengkapnya dapat dilihat
pada lampiran 23 sampai 28. Tabel 4. Retention Time beberapa asam amino standar
No. Asam amino
Retention Time 1 Crn
2.193 2 Glu
2.415 3 His
2.853 4 Phe
4.717 5 Trp
8.777 6 Tyr
1.980 Fraksi 1 mempunyai peak yang mendekati Retention Time Glu 2.432
dengan Luas area 27.146 dan yang mendekati Retention Time Phe 4.872 dengan luas area 14.336. Dari data tersebut diduga pada Fraksi 1 terdapat asam
amino Glu dan Phe. Pada Fraksi 2 mempunyai peak yang mendekati Retention Time
Crn 2.102 dengan luas area 48.720. Fraksi 3, Fraksi 4, Fraksi 5 dan Fraksi 7 tidak ada peak yang mendekati Retention Time asam amino standar pada Tabel
4. pada fraksi-fraksi tersebut tidak mengandung asam-asam amino yang ada pada Tabel 4. Fraksi 6 mempunyai peak dengan Retention Time Tyr 1.925 dengan
luas area 5.683. Fraksi Tidak Tertahan mempunyai peak yang mendekati Retention Time
Phe 4.723 dengan luas area 9.159.
54
V. KESIMPULAN DAN SARAN
