42 difraksinasi lebih lenjut menggunakan tiga membran dengan Molecular
Weight Cut Off MWCO berturut-turut 10.000, 3.000, dan 1.000 Da. Proses
ultrafiltrasi ini menghasilkan fraksi yang mempunyai BM kurang dari 1000 Da. Adanya kandungan lemak yang masih terdapat pada sampel menyebabkan
terganggunya pemisahan pada proses ultrafiltrasi. Retensi molekul yang mempunyai BM rendah selain dipengaruhi oleh ukuran, juga banyak
dipengaruhi oleh faktor sterik, derajat hidrasi dan panjang ikatan.
B. Fraksinasi dengan Kromatografi Filtrasi Gel Sephadex G-10
Fraksinasi selanjutnya setelah didapat fraksi dengan BM1000 Da adalah kromatografi filtrasi gel dengan Sephadex G-10. Prinsip pemisahan
pada kromatografi filtrasi gel ini adalah pemisahan campuran senyawa berdasarkan berat molekulnya, molekul yang lebih besar dari ukuran pori pada
gel akan turun lebih dulu baru diikuti oleh molekul yang lebih kecil. Proses eksklusi dapat dilihat pada Gambar. 9.
Gambar 9. Pemisahan molekul besar dan molekul kecil dalam kromatografi
filtrasi gel. Gel merupakan struktur tiga dimensi yang terbentuk karena adanya
ikatan silang yang terbentuk karena adanya proses polimerisasi. Pada percobaan ini digunakan gel Sephadex G-10 dengan ukuran serbuk kering
dengan variasi 10-40 μm, dapat mengikat air 4-6 mlg kering, mampu
memisahkan protein globular dan protein dekstran dengan berat molekul
43
Kromatogram Filtrasi Gel Sephadex G-10 dan Kadar Garam
2 4
6 8
10 12
1 7
13 19 25 31 37 43 49
Nomor Tabung A
b so
rb an
s i
Kadar NaCl Absorbansi 240
nm
Gambar 10. Hasil fraksinasi dari fraksi BM1000 Da dari ikan jambal roti dengan kolom sephadex G-10, panjang 44.6 cm dan diameter
1.5 cm. pada absorbansi 240 nm. kurang dari 700 Hargis, 1988. Selain itu gel jenis ini banyak digunakan
untuk pemisahan protein dan senyawa-senyawa berberat molekul besar. Sephadex dibuat dari polisakarida dekstran. Karena setiap residu glukosa
mempunyai tiga gugus OH maka dekstran merupakan molekul yang polar. Pembentukan ikatan silang terjadi dengan epiklorohidrin.
Banyaknya ikatan silang dalam gel yang terbentuk akan sangat mempengaruhi proses eksklusi molekul-molekul yang akan dipisahkan. Selain
ukuran pori pada gel, jenis gel juga berpengaruh pada proses pemisahan. Gel yang terbentuk dari dekstran yang mempunyai ikatan silang epiklorohidrin
akan berinteraksi terhadap komponen aromatik dalam fraksi BM1000 Da. Akibat dari interaksi ini fraksi yang lebih banyak mengandung komponen
aromatik akan lebih lama ditahan oleh kolom Hagel, 1998. Selain itu, kromatografi filtrasi gel juga dapat berfungsi untuk memisahkan garam yang
terdapat pada sampel Hagel, 1998. Pemisahan garam ini dilakukan untuk mencegah adanya efek sinergis garam terhadap rasa gurih pada saat dilakukan
uji sensori. Pemisahan sampel menggunakan kromatografi filtrasi gel Sephadex G-
10 menghasilkan lima fraksi seperti yang ditunjukkan oleh Gambar 10. Selanjutnya kelima fraksi tersebut disebut sebagai fraksi 1, fraksi 2, fraksi 3,
fraksi 4, dan fraksi 5.
44 Penentuan fraksi ini didasarkan pada peak yang terbentuk dari hasil
pengukuran absorbansi dari tabung-tabung pada kromatografi filtrasi gel pada panjang gelombang 240 nm dan adanya garam pada sampel. Karakterisasi
fraksi yang dilakukan Rahmawaty 2004 mengungkapkan bahwa fraksi 1 hasil kromatografi filtrasi gel Sephadex G-10 dari ekstrak ikan asin jambal roti
mempunyai kadar peptida terlarut tertinggi dan kadar α amino terendah
dibanding fraksi-fraksi yang lain. Fraksi 1 yang dihasilkan dari kromatografi filtrasi gel banyak mengandung komponen berberat molekul lebih tinggi
dibanding fraksi yang lain, hal ini disebabkan karena pada kromatografi filtrasi gel pemisahan antar senyawanya berdasarkan berat molekul. Dan
molekul yang lebih besar akan keluar lebih dulu. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Rahmawaty 2004, fraksi 1 banyak mengandung komponen yang
memiliki berat molekul yang lebih tinggi seperti peptida. Disamping itu fraksi 1 juga mengandung asam amino bebas, asam-asam volatil, dan garam-garam
anorganik. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Hagel 1998 yang menyatakan bahwa pemisahan menggunakan Sephadex juga didasarkan pada
sifat hidrofobisitas sampel dan interaksi antar komponen selain faktor berat molekul.
Pengukuran kadar garam bertujuan untuk mengetahui pengaruh keberadaan garam terhadap rasa gurih pada fraksi sehingga abiguitas rasa
fraksi pada saat uji sensori dapat dicegah. Efektivitas proses fraksinasi pada kromatografi filtrasi gel juga dapat diketahui dari pengukuran kadar garam ini.
Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi yang mengandung garam muncul sebagai peak tunggal yang tajam yaitu terdapat pada fraksi dua.
Garam ini rata-rata muncul pada tabung 7 sampai 10. Dari hasil tersebut maka pemisahan garam dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel Sephadex G-
10 cukup efektif karena garam hanya terdapat pada satu fraksi dan pada kisaran tabung yang pendek.
Mineral seperti sodium dan klorida memiliki peranan penting dalam memproduksi rasa spesifik. Penelitian yang dilakukan Konusu et al. 1978
dan Hayasshi et al. 1978 menunjukkan pada ekstrak sintetik yang kadar ion
45 sodiumnya rendah, mengalami penurunan rasa manis, gurih dan meningkatkan
rasa pahit.
C. Fraksinasi dengan Solid Phase Extraction SPE
