32
III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan asin jambal roti yang diperoleh dari Pelabuhan Ratu, Sukabumi Gambar 4. Ikan asin
sebelum diekstrak dilakukan penggorengan dengan minyak goreng merek Bimoli.
Gambar 4. Ikan asin jambal roti Fraksinasi dilakukan menggunakan membran 0,45
μm Millipore dan Molecular Weight Cut-Off
MWCO berturut-turut 10.000, 3.000 dan 1.000 dalton. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis adalah asam klorida,
natrium hidroksida, perak nitrat, kalium kromat, natrium karbonat, tembaga sulfat, natrium kalium tartarat, bovin serum albumin, kalium sulfat E.
Merck, merkuri oksida, asam borat, etanol, natrium tiosulfat, indikator metil merah, indikator metil biru, pereaksi Folin-Ciocalteau.
Peralatan yang digunakan untuk persiapan sampel dan analisis adalah blender, peralatan gelas, pH meter Orion 410 A, neraca analitik AND GR-
200, sentrifus IEC Centra - 8, USA, freeze dryer Yamato, Japan, spektrofotometer Shimadzu UV-160 Shimadzu Co., Japan, stirred cell
33 ultrafiltration
kapasitas 50 ml Amicon Inc., Beverly, MA, High Performance Liquid Chromatography
Shimadzu Co., Japan.
B. METODE PENELITIAN Ekstraksi
Daging ikan asin jambal roti digoreng selama 3 menit dalam minyak goreng, kemudian ditambah air, dihaluskan dengan blender 2 x 1 menit dan
disaring dengan kain saring. Kedua suspensi yang diperoleh disentrifus 4000 rpm, 4
O
C, 30 menit dan disaring menggunakan kertas saring, sehingga diperoleh ekstrak larut air Gambar 5.
daging ikan asin jambal roti digoreng dalam 500 ml minyak goreng 3 menit
ditambah 600 ml air 1 : 2 bv diblender 2 x 1 menit
disaring disentrifus 4000 rpm, 4
O
C, 30 menit disaring
Gambar 5. Diagram alir proses ekstraksi.
Ultrafiltrasi
Ultrafiltrasi bertujuan untuk mendapatkan fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Dalton. Sebelumnya ekstrak sampel diultrasentrifuse
terlebih dahulu pada kecepatan 20.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4
o
C dengan tujuan untuk memisahkan lemak dan memperoleh filtrat yang lebih
Ekstrak Larut Air
34 jernih. Setelah ultrasentrifuse, lemak akan memadat dan membentuk lapisan
dibagian atas tabung. Lapisan lemak tersebut mudah dibuang dengan bantuan pinset. Filtrat yang jernih diambil untuk diultrafiltrasi. Filtrat ini disebut
sebagai ektrak air ikan asin jambal roti. Hal tersebut dilakukan untuk memperoleh fraksi dengan berat molekul
kurang dari 1000 Da yang selanjutnya disebut Fraksi BM1000 Da. Fraksi BM1000 Da dikeringkan dengan cara pengeringan beku.
Sebelum digunakan, membran fraksinasi dibilas dengan cara merendam membran dalam air destilata selama 1 jam, air diganti 3 kali selama
perendaman untuk menghilangkan bahan pengawet membran. Selanjutnya, membran direndam dalam larutan NaCl selama 30 menit untuk
menghilangkan komponen yang menyerap sinar UV. Membran ditempatkan dalam stirred cell dengan sisi mengkilap dibagian atas. Sampel dimasukkan
dalam reservoar dan ditutup rapat. Gas nitrogen dialirkan sampai tekanan 2.5-3.0 bar dan stirrer dinyalakan pada skala kecepatan 6-7. Filtrat ditampung
dalam gelas ukur sampai volume tertentu. Setelah selesai gas nitrogen ditutup dan katup pada sirred cell dibuka. Filtrat disimpan dalam botol gelas pada
suhu –20
o
C. Setelah digunakan membran dalam NaOH 0.1 Mselama 30 menit, kemudian dibilas air destilata dan disimpan dalam etanol 10 pada
suhu refrigerator.
Fraksinasi dengan Kromatografi Filtrasi Gel
Fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel dengan menggunakan Sephadex G-10 dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan fraksi yang
terdapat dalam fraksi BM 1000 Da dan bersamaan dengan itu sebagian besar garam dapat dipisahkan. Kolom yang dipack dengan Sephadex tersebut
berukuran 1.5 x 60 cm diameter x tinggi. Pemisahan fraksi dilakukan dengan eluen air bebas ion, suhu 2-5 ºC dan tekanan atmosfer. Untuk kecap ikan
dengan flow rate 0.2 mlmenit, ikan asin jambal roti 0.4 mlmenit dan ikan peda
Prosedur fraksinasi dengan kromatografi filtrasi secara lengkap dapat dilihat pada Gambar 6.
35 Fraksi BM 1000 Da kering beku
¾ Ditimbang sebanyak 1.0 gram
¾ Dilarutkan dalam 5.0 ml air bebas ion
¾ Dimasukkan dalam kolom dengan bantuan pipet
¾ Dikumpulkan 50 tabung, masing-masing sejumlah 4 ml
¾ Dianalisis
- Absorbansi pada
λ 240 nm - Kadar garam NaCl
¾ Dikumpulkan menjadi 5 fraksi
¾ Pengeringan beku
Gambar 6. Bagan Alir Fraksinasi Hasil Ultrafiltrasi Fraksi BM 1000 Da dengan Kolom Sephadex G-10, panjang 60 dan diameter 1.5 cm
Dalam satu kali running, sampel hasil ultrafiltrasi Fraksi BM 1000 Da yang telah dikeringbekukan ditimbang sebanyak 1.0 g dan dilarutkan dalam 5
ml air bebas ion. Larutan disaring terlebih dahulu menggunakan membran 0.45
μm pada kondisi vakum, baru dimasukkan ke dalam kolom dengan bantuan pipet. Kemudian dilakukan elusi menggunakan air bebas ion sebagai
eluen. Eluat yang ditampung adalah sebanyak 50 tabung dengan volume masing-masing 4.0 ml. Eluat yang terdapat dalam masing-masing tabung
diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 240 nm sehingga diperoleh grafik hasil kromatografi. Berdasarkan grafik maka
ditentukan pembagian fraksi. Selain itu, dilakukan pula pengukuran kadar garamnya sehingga dapat dilihat tabung mana yang mengandung garam. Berat
masing-masing fraksi keringbeku ditimbang beratnya dengan timbangan analitik.
Karakterisasi Kimia Fraksi-fraksi Hasil Kromatografi Kadar Garam
Analisis kadar garam dilakukan dengan metode Mohr Apriyantono et al., 1989. Sampel dari masing-masing tabung dari proses fraksinasi dengan
36 Sephadex g-10 dipipet sebanyak 0.25 ml, kemudian ditambah 5 ml akuades
dan 1 ml larutan Potasium kromat 5 , selanjutnya dititrasi dengan larutan perak nitrat 0.1 M. Titik akhir titrasi ditandai dengan warna merah jingga.
Kadar garam dapat dihitung dengan rumus:
Garam NaCl = Titer x M x 5.84ml sampel
Fraksinasi Fraksi Tergurih Menggunakan Solid Phase Extraction SPE
Fraksi tergurih dari hasil kromatografi filtrasi gel Sephadex G-10
difraksinasi lebih lanjut menggunakan SPE Solid Phase Extraction. Kolom
yang dipakai pada SPE ini adalah C-18 Supelclean LC-18 dalam bentuk Cartridge
. Alat SPE yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 7.
Gambar 7. Solid Phase Extraction SPE Kolom yang akan dipakai untuk fraksinasi, dilakukan conditioning
terlebih dahulu. Kolom dielusi dengan methanol 2 ml, kemudian dielusi dengan 2 ml air bebas ion. Sampel sebanyak 2 ml kemudian dimasukkan ke
kolom dan didiamkan selama beberapa saat agar komponen-komponen yang terdapat pada fraksi terikat oleh kolom. Sisa sampel yang tidak terikat
kemudian dibiarkan mengalir dan dinyatakan sebagai fraksi tidak tertahan.
37 Sampel kemudian dielusi dengan eluen 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40 ACN acetronitrile dalam air. Eluen yang keluar dari kolom beserta sampel dikoleksi dan dinyatakan sebagai fraksi peptida berdasarkan
konsentrasi eluen tersebut. Proses SPE dapat dilihat pada gambar 8. Cartridge
dielusi dengan 2 metanol dan 2 ml air conditioning 2 ml sampel ditempatkan pada cartridge
Dibiarkan terikat dengan kolom Dielusi dengan ACN 10
Dielusi dengan ACN 15 Dielusi dengan ACN 20
Dielusi dengan ACN 25 Dielusi dengan ACN 30
Dielusi dengan ACN 35 Dielusi dengan ACN 40
Gambar 8. Diagram alir proses Solid Phase Extraction SPE
Karakteristik Sensori Fraksi-fraksi Hasil Solid Phase Extraction SPE
Analisis sensori sampel menggunakan uji skoring untuk menggambarkan karakteristik sensori dari produk dalam bentuk matematis atau numerik.
Fraksi 1 Fraksi Tidak
Tertahan
Fraksi 2 Fraksi 3
Fraksi 7 Fraksi 6
Fraksi 4 Fraksi 5
38 Langkah-langkah yang dikerjakan dalam melakukan uji intensitas adalah
sebagai berikut:
Seleksi Panelis
Pada tahap ini dicari calon panelis yang telah mengetahui atau pernah melakukan uji sensori secara umum. Dalam uji ini digunakan 60 orang calon
panelis terlatih. Calon panelis yang terpilih diuji menggunakan uji deskripsi terhadap lima rasa dasar yaitu: 8.6 mM sukrosa rasa manis, 9.97 mM NaCl
rasa asin, 0.74 mM kaffein rasa pahit, 0.43 asam sitrat rasa asam dan rasa gurih menggunakan MSG 1.42 mM Metode Jellinek, 1985. Kemudian
panelis yang terpilih diminta persetujuannya untuk mengikuti serangkaian uji sensori yang dilakukan pada tahap selanjutnya. Contoh form seleksi panelis
dan hasil uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 1, 6 dan 7.
Pengujian Panelis
Calon panelis yang terpilih pada tahap seleksi awal sebanyak 30 calon panelis, diuji kepekaan dan konsistensi indera pencicipnya dengan
menggunakan uji segitiga dan uji rangking. Pada pelaksanaan uji segitiga, uji difokuskan pada larutan sampel asin
dan gurih. Pada masing-masing jenis larutan, calon panelis diberi tiga sampel dimana satu sampel memiliki karakteristik yang berbeda, dilakukan penyajian
sebanyak lima kali dengan tiga kali ulangan. Konsentrasi larutan garam yang digunakan adalah 8.000 gl dan 10.000 gl, sedangkan larutan MSG yang
digunakan 0.600 gl dan 1.000 gl. Uji rangking dilakukan terhadap rasa asin dan gurih. Pada uji ini panelis
diminta mencicipi satu set larutan garam atau larutan MSG, lalu mengurutkannya dari yang kurang gurih sampai paling gurih. Konsentrasi
larutan garam yang digunakan yaitu 2.000 gl, 5.000 gl, 8.000 gl, 10.000 gl dan 13.000 gl. Sedangkan konsentrasi larutan MSG yang digunakan adalah
0.200 gl, 0.600 gl, 1.000 gl, 1.600 gl, dan 2.600 gl. Contoh form uji segitiga dan rangking dapat dilihat di Lampiran 2, 3, dan 4.
39 Panelis dipilih adalah panelis yang dapat memberikan jawaban benar
diatas atau sama dengan 80 untuk uji rangking Carpenter, 2000 dan diatas atau sama dengan 60 untuk uji segitiga Meilgaar et al., 1999. Selain itu,
dipilih pula berdasarkan kekonsistenan panelis dalam tiga kali ulangan pengujian dan kesediaannya dalam mengikuti tahap selanjutnya. Hasil dari uji
tersebut dapat dilihat di Lampiran 7. Panelis yang telah dipilih sebanyak 17 orang.
Pelatihan Panelis
Panelis yang telah lulus dari pengujian, selanjutnya dilatih kepekaannya terhadap intensitas rasa gurih dan asin dalam campuran larutan dengan uji
rangking. Uji tersebut dilakukan dengan mengkombinasikan larutan MSG yang konsentrasinya 0.5 bv, 0.2 bv dan 0.3 bv dengan larutan
garam yang konsentrasinya 0.5 bv, 1.0 bv dan 1.5 bv. Uji tersebut dilakukan sebanyak empat kali ulangan. Contoh Hasil pelatihan
panelis dengan uji rangking dapat dilihat di Lampiran 8. Selain itu, dilakukan pula pelatihan untuk mengenal sifat-sifat sensori
sampel dengan uji intensitas. Uji intensitas dilakukan terhadapa rasa asin dan rasa gurih dari sampel dengan konsentrasi 0.1 bv, 0.5 bv dan 1.0
bv. Pelatihan panelis dilakukan sebanyak tiga kali ulangan pada hari yang berbeda. Jumlah ulangan tersebut dianggap cukup hingga penilaian panelis
terhadap satu sampel konsisten. Panelis diharapkan dapat menilai sampel dengan skor tinggi maupun skor rendah menurut konsentrasi sampel yang
dibuat seperti diatas. Selain itu, penilaian tidak ekstrim dan berada pada rata- rata penilaian panelis. Contoh form pelatihan panelis tersebut dapat dilihat
pada Lampiran 5, sedangkan hasil penilaian uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 10 dan 11. Pada uji intensitas dalam pelatihan panelis dan pengujian
sampel, sampel diberikan standar untuk mempermudah justifikasi kisaran intensitas.
Pengujian Sampel
40 Pengujian sampel hasil fraksinasi dengan Solid Phase Extraction SPE yang
telah dikeringbekukan dilakukan uji skoring. Dari hasil SPE diperoleh 8 fraksi dengan dua kali ulangan yang akan diuji organoleptik. Pengujian
dilakukan terhadap sampel utuh hasil SPE tanpa modifikasi penyamaan kadar garam dan penyamaan total padatan. Standar yang digunakan sama dengan
standar pelatihan panelis. Kemudian data diolah dengan menggunakan Program Windows Excel untuk mengukur mean dan standar deviasi. Contoh
form Pengujian sampel tersebut dapat dilihat pada Lampiran 5, sedangkan hasil penilaian uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 12 sampai 13.
Pengamatan profil peptida hasil SPE dengan RP-HPLC
Pengamatan profil fraksi peptida hasil SPE dilakukan dengan RP-HPLC. Sampel hasil kromatografi gel dibandingkan dengan fraksi-fraksi hasil SPE
sehingga bisa diketahui sejauh mana keefektifan pemisahan dengan menggunakan SPE. Sampel dielusi dengan campuran air dan acetonitrile dengan sistem gradien
pada konsentrasi 2-30 acetonitrile selama 30 menit.
41
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN