BAHAN DAN ALAT METODE PENELITIAN Ekstraksi

32

III. BAHAN DAN METODE PENELITIAN

A. BAHAN DAN ALAT

Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan asin jambal roti yang diperoleh dari Pelabuhan Ratu, Sukabumi Gambar 4. Ikan asin sebelum diekstrak dilakukan penggorengan dengan minyak goreng merek Bimoli. Gambar 4. Ikan asin jambal roti Fraksinasi dilakukan menggunakan membran 0,45 μm Millipore dan Molecular Weight Cut-Off MWCO berturut-turut 10.000, 3.000 dan 1.000 dalton. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis adalah asam klorida, natrium hidroksida, perak nitrat, kalium kromat, natrium karbonat, tembaga sulfat, natrium kalium tartarat, bovin serum albumin, kalium sulfat E. Merck, merkuri oksida, asam borat, etanol, natrium tiosulfat, indikator metil merah, indikator metil biru, pereaksi Folin-Ciocalteau. Peralatan yang digunakan untuk persiapan sampel dan analisis adalah blender, peralatan gelas, pH meter Orion 410 A, neraca analitik AND GR- 200, sentrifus IEC Centra - 8, USA, freeze dryer Yamato, Japan, spektrofotometer Shimadzu UV-160 Shimadzu Co., Japan, stirred cell 33 ultrafiltration kapasitas 50 ml Amicon Inc., Beverly, MA, High Performance Liquid Chromatography Shimadzu Co., Japan.

B. METODE PENELITIAN Ekstraksi

Daging ikan asin jambal roti digoreng selama 3 menit dalam minyak goreng, kemudian ditambah air, dihaluskan dengan blender 2 x 1 menit dan disaring dengan kain saring. Kedua suspensi yang diperoleh disentrifus 4000 rpm, 4 O C, 30 menit dan disaring menggunakan kertas saring, sehingga diperoleh ekstrak larut air Gambar 5. daging ikan asin jambal roti digoreng dalam 500 ml minyak goreng 3 menit ditambah 600 ml air 1 : 2 bv diblender 2 x 1 menit disaring disentrifus 4000 rpm, 4 O C, 30 menit disaring Gambar 5. Diagram alir proses ekstraksi. Ultrafiltrasi Ultrafiltrasi bertujuan untuk mendapatkan fraksi berberat molekul kurang dari 1000 Dalton. Sebelumnya ekstrak sampel diultrasentrifuse terlebih dahulu pada kecepatan 20.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 o C dengan tujuan untuk memisahkan lemak dan memperoleh filtrat yang lebih Ekstrak Larut Air 34 jernih. Setelah ultrasentrifuse, lemak akan memadat dan membentuk lapisan dibagian atas tabung. Lapisan lemak tersebut mudah dibuang dengan bantuan pinset. Filtrat yang jernih diambil untuk diultrafiltrasi. Filtrat ini disebut sebagai ektrak air ikan asin jambal roti. Hal tersebut dilakukan untuk memperoleh fraksi dengan berat molekul kurang dari 1000 Da yang selanjutnya disebut Fraksi BM1000 Da. Fraksi BM1000 Da dikeringkan dengan cara pengeringan beku. Sebelum digunakan, membran fraksinasi dibilas dengan cara merendam membran dalam air destilata selama 1 jam, air diganti 3 kali selama perendaman untuk menghilangkan bahan pengawet membran. Selanjutnya, membran direndam dalam larutan NaCl selama 30 menit untuk menghilangkan komponen yang menyerap sinar UV. Membran ditempatkan dalam stirred cell dengan sisi mengkilap dibagian atas. Sampel dimasukkan dalam reservoar dan ditutup rapat. Gas nitrogen dialirkan sampai tekanan 2.5-3.0 bar dan stirrer dinyalakan pada skala kecepatan 6-7. Filtrat ditampung dalam gelas ukur sampai volume tertentu. Setelah selesai gas nitrogen ditutup dan katup pada sirred cell dibuka. Filtrat disimpan dalam botol gelas pada suhu –20 o C. Setelah digunakan membran dalam NaOH 0.1 Mselama 30 menit, kemudian dibilas air destilata dan disimpan dalam etanol 10 pada suhu refrigerator. Fraksinasi dengan Kromatografi Filtrasi Gel Fraksinasi dengan kromatografi filtrasi gel dengan menggunakan Sephadex G-10 dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan fraksi yang terdapat dalam fraksi BM 1000 Da dan bersamaan dengan itu sebagian besar garam dapat dipisahkan. Kolom yang dipack dengan Sephadex tersebut berukuran 1.5 x 60 cm diameter x tinggi. Pemisahan fraksi dilakukan dengan eluen air bebas ion, suhu 2-5 ºC dan tekanan atmosfer. Untuk kecap ikan dengan flow rate 0.2 mlmenit, ikan asin jambal roti 0.4 mlmenit dan ikan peda Prosedur fraksinasi dengan kromatografi filtrasi secara lengkap dapat dilihat pada Gambar 6. 35 Fraksi BM 1000 Da kering beku ¾ Ditimbang sebanyak 1.0 gram ¾ Dilarutkan dalam 5.0 ml air bebas ion ¾ Dimasukkan dalam kolom dengan bantuan pipet ¾ Dikumpulkan 50 tabung, masing-masing sejumlah 4 ml ¾ Dianalisis - Absorbansi pada λ 240 nm - Kadar garam NaCl ¾ Dikumpulkan menjadi 5 fraksi ¾ Pengeringan beku Gambar 6. Bagan Alir Fraksinasi Hasil Ultrafiltrasi Fraksi BM 1000 Da dengan Kolom Sephadex G-10, panjang 60 dan diameter 1.5 cm Dalam satu kali running, sampel hasil ultrafiltrasi Fraksi BM 1000 Da yang telah dikeringbekukan ditimbang sebanyak 1.0 g dan dilarutkan dalam 5 ml air bebas ion. Larutan disaring terlebih dahulu menggunakan membran 0.45 μm pada kondisi vakum, baru dimasukkan ke dalam kolom dengan bantuan pipet. Kemudian dilakukan elusi menggunakan air bebas ion sebagai eluen. Eluat yang ditampung adalah sebanyak 50 tabung dengan volume masing-masing 4.0 ml. Eluat yang terdapat dalam masing-masing tabung diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 240 nm sehingga diperoleh grafik hasil kromatografi. Berdasarkan grafik maka ditentukan pembagian fraksi. Selain itu, dilakukan pula pengukuran kadar garamnya sehingga dapat dilihat tabung mana yang mengandung garam. Berat masing-masing fraksi keringbeku ditimbang beratnya dengan timbangan analitik. Karakterisasi Kimia Fraksi-fraksi Hasil Kromatografi Kadar Garam Analisis kadar garam dilakukan dengan metode Mohr Apriyantono et al., 1989. Sampel dari masing-masing tabung dari proses fraksinasi dengan 36 Sephadex g-10 dipipet sebanyak 0.25 ml, kemudian ditambah 5 ml akuades dan 1 ml larutan Potasium kromat 5 , selanjutnya dititrasi dengan larutan perak nitrat 0.1 M. Titik akhir titrasi ditandai dengan warna merah jingga. Kadar garam dapat dihitung dengan rumus: Garam NaCl = Titer x M x 5.84ml sampel Fraksinasi Fraksi Tergurih Menggunakan Solid Phase Extraction SPE Fraksi tergurih dari hasil kromatografi filtrasi gel Sephadex G-10 difraksinasi lebih lanjut menggunakan SPE Solid Phase Extraction. Kolom yang dipakai pada SPE ini adalah C-18 Supelclean LC-18 dalam bentuk Cartridge . Alat SPE yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 7. Gambar 7. Solid Phase Extraction SPE Kolom yang akan dipakai untuk fraksinasi, dilakukan conditioning terlebih dahulu. Kolom dielusi dengan methanol 2 ml, kemudian dielusi dengan 2 ml air bebas ion. Sampel sebanyak 2 ml kemudian dimasukkan ke kolom dan didiamkan selama beberapa saat agar komponen-komponen yang terdapat pada fraksi terikat oleh kolom. Sisa sampel yang tidak terikat kemudian dibiarkan mengalir dan dinyatakan sebagai fraksi tidak tertahan. 37 Sampel kemudian dielusi dengan eluen 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ACN acetronitrile dalam air. Eluen yang keluar dari kolom beserta sampel dikoleksi dan dinyatakan sebagai fraksi peptida berdasarkan konsentrasi eluen tersebut. Proses SPE dapat dilihat pada gambar 8. Cartridge dielusi dengan 2 metanol dan 2 ml air conditioning 2 ml sampel ditempatkan pada cartridge Dibiarkan terikat dengan kolom Dielusi dengan ACN 10 Dielusi dengan ACN 15 Dielusi dengan ACN 20 Dielusi dengan ACN 25 Dielusi dengan ACN 30 Dielusi dengan ACN 35 Dielusi dengan ACN 40 Gambar 8. Diagram alir proses Solid Phase Extraction SPE Karakteristik Sensori Fraksi-fraksi Hasil Solid Phase Extraction SPE Analisis sensori sampel menggunakan uji skoring untuk menggambarkan karakteristik sensori dari produk dalam bentuk matematis atau numerik. Fraksi 1 Fraksi Tidak Tertahan Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 7 Fraksi 6 Fraksi 4 Fraksi 5 38 Langkah-langkah yang dikerjakan dalam melakukan uji intensitas adalah sebagai berikut: Seleksi Panelis Pada tahap ini dicari calon panelis yang telah mengetahui atau pernah melakukan uji sensori secara umum. Dalam uji ini digunakan 60 orang calon panelis terlatih. Calon panelis yang terpilih diuji menggunakan uji deskripsi terhadap lima rasa dasar yaitu: 8.6 mM sukrosa rasa manis, 9.97 mM NaCl rasa asin, 0.74 mM kaffein rasa pahit, 0.43 asam sitrat rasa asam dan rasa gurih menggunakan MSG 1.42 mM Metode Jellinek, 1985. Kemudian panelis yang terpilih diminta persetujuannya untuk mengikuti serangkaian uji sensori yang dilakukan pada tahap selanjutnya. Contoh form seleksi panelis dan hasil uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 1, 6 dan 7. Pengujian Panelis Calon panelis yang terpilih pada tahap seleksi awal sebanyak 30 calon panelis, diuji kepekaan dan konsistensi indera pencicipnya dengan menggunakan uji segitiga dan uji rangking. Pada pelaksanaan uji segitiga, uji difokuskan pada larutan sampel asin dan gurih. Pada masing-masing jenis larutan, calon panelis diberi tiga sampel dimana satu sampel memiliki karakteristik yang berbeda, dilakukan penyajian sebanyak lima kali dengan tiga kali ulangan. Konsentrasi larutan garam yang digunakan adalah 8.000 gl dan 10.000 gl, sedangkan larutan MSG yang digunakan 0.600 gl dan 1.000 gl. Uji rangking dilakukan terhadap rasa asin dan gurih. Pada uji ini panelis diminta mencicipi satu set larutan garam atau larutan MSG, lalu mengurutkannya dari yang kurang gurih sampai paling gurih. Konsentrasi larutan garam yang digunakan yaitu 2.000 gl, 5.000 gl, 8.000 gl, 10.000 gl dan 13.000 gl. Sedangkan konsentrasi larutan MSG yang digunakan adalah 0.200 gl, 0.600 gl, 1.000 gl, 1.600 gl, dan 2.600 gl. Contoh form uji segitiga dan rangking dapat dilihat di Lampiran 2, 3, dan 4. 39 Panelis dipilih adalah panelis yang dapat memberikan jawaban benar diatas atau sama dengan 80 untuk uji rangking Carpenter, 2000 dan diatas atau sama dengan 60 untuk uji segitiga Meilgaar et al., 1999. Selain itu, dipilih pula berdasarkan kekonsistenan panelis dalam tiga kali ulangan pengujian dan kesediaannya dalam mengikuti tahap selanjutnya. Hasil dari uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 7. Panelis yang telah dipilih sebanyak 17 orang. Pelatihan Panelis Panelis yang telah lulus dari pengujian, selanjutnya dilatih kepekaannya terhadap intensitas rasa gurih dan asin dalam campuran larutan dengan uji rangking. Uji tersebut dilakukan dengan mengkombinasikan larutan MSG yang konsentrasinya 0.5 bv, 0.2 bv dan 0.3 bv dengan larutan garam yang konsentrasinya 0.5 bv, 1.0 bv dan 1.5 bv. Uji tersebut dilakukan sebanyak empat kali ulangan. Contoh Hasil pelatihan panelis dengan uji rangking dapat dilihat di Lampiran 8. Selain itu, dilakukan pula pelatihan untuk mengenal sifat-sifat sensori sampel dengan uji intensitas. Uji intensitas dilakukan terhadapa rasa asin dan rasa gurih dari sampel dengan konsentrasi 0.1 bv, 0.5 bv dan 1.0 bv. Pelatihan panelis dilakukan sebanyak tiga kali ulangan pada hari yang berbeda. Jumlah ulangan tersebut dianggap cukup hingga penilaian panelis terhadap satu sampel konsisten. Panelis diharapkan dapat menilai sampel dengan skor tinggi maupun skor rendah menurut konsentrasi sampel yang dibuat seperti diatas. Selain itu, penilaian tidak ekstrim dan berada pada rata- rata penilaian panelis. Contoh form pelatihan panelis tersebut dapat dilihat pada Lampiran 5, sedangkan hasil penilaian uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 10 dan 11. Pada uji intensitas dalam pelatihan panelis dan pengujian sampel, sampel diberikan standar untuk mempermudah justifikasi kisaran intensitas. Pengujian Sampel 40 Pengujian sampel hasil fraksinasi dengan Solid Phase Extraction SPE yang telah dikeringbekukan dilakukan uji skoring. Dari hasil SPE diperoleh 8 fraksi dengan dua kali ulangan yang akan diuji organoleptik. Pengujian dilakukan terhadap sampel utuh hasil SPE tanpa modifikasi penyamaan kadar garam dan penyamaan total padatan. Standar yang digunakan sama dengan standar pelatihan panelis. Kemudian data diolah dengan menggunakan Program Windows Excel untuk mengukur mean dan standar deviasi. Contoh form Pengujian sampel tersebut dapat dilihat pada Lampiran 5, sedangkan hasil penilaian uji tersebut dapat dilihat di Lampiran 12 sampai 13. Pengamatan profil peptida hasil SPE dengan RP-HPLC Pengamatan profil fraksi peptida hasil SPE dilakukan dengan RP-HPLC. Sampel hasil kromatografi gel dibandingkan dengan fraksi-fraksi hasil SPE sehingga bisa diketahui sejauh mana keefektifan pemisahan dengan menggunakan SPE. Sampel dielusi dengan campuran air dan acetonitrile dengan sistem gradien pada konsentrasi 2-30 acetonitrile selama 30 menit. 41

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN