Implikasi klinis disfungsi endotel Struktur protein PAI-1

Gambar 2.6. Hubungan hiperglikemia dengan inflamasi. dikutip dari Funk, Yurdagul dan Orr , 2012.

b. Implikasi klinis disfungsi endotel

Endotel berfungsi mempertahankan homeostasis vaskuler melalui kompleks interaksi multipel antar sel pada lumen dan dinding pembuluh darah. Pertama, endotel mengatur tonus vaskuler dengan menyeimbangkan antara vasodilator dan vasokonstrikor. Kedua, endotel mengontrol blood fluidity and coagulation dengan memproduksi faktor-faktor yang mengatur aktivitas platelet, kaskade koagulasi dan fibrinolisis. Ketiga, endotel mempunyai kemampuan memproduksi sitokin dan molekul adhesi yang mengatur proses inflamasi Widlansky et al., 2003. Disfungsi endotel merujuk pada kondisi menurunnya kemampuan endotel untuk mempertahankan homeostasis vaskuler, baik pada kondisi basal ataupun perpustakaan.uns.ac.id commit to user setelah stimulasi, sehingga terjadi perburukan fungsi organ Van den Oever et al., 2010; Balasubramanian et al., 2012. Disfungsi endotel akan memicu endotel untuk mengekspresikan sitokin proinflamasi, yaitu TNF- α, IL-1β, IL-6 dan TGF-β1. Bila proses ini tidak terkontrol dalam jangka waktu yang lama akan mengakibatkan aterosklerosis dan komplikasi pada target organ, yaitu ginjal, jantung, pembuluh darah koroner dan serebral Van den Oever et al., 2010; Bambang, 2012.

c. Diabetes melitus, disfungsi endotel dan protrombosis

Endotel memproduksi molekul protrombosis seperti TF, PAI-1, thromboxane dan vWF von Willibrand’s factor dalam kondisi seimbang dengan produksi molekul antitrombosis seperti NO, heparin, tPA dan trombomodulin. Pada DM, keseimbangan tersebut bergeser ke kondisi protrombosis dan antifibrinolisis. Hal ini terjadi akibat menurunnya sinyal melalui PI-3K pathway tetapi tidak terjadi gangguan sinyal yang melalui MAPK pathway yang merupakan ciri khas resistensi insulin pada DM tipe 2. Terjadi juga peningkatan aktivitas NADPH oksidase sehingga produksi superoksida O 2 - meningkat Balasubramaniam et al., 2012. ROS akan menurunkan NO dan mengaktivasi NFĸβ sehingga mengaktivasi transkripsi gen untuk produksi VCAM-1, e-selectin, ICAM, IL-1, IL-6, IL-8, TF, PAI dan iNOS Van den Oever et al., 2010; Funk, Yurdagul dan Orr, 2012. Hubungan antara inflamasi dengan koagulasi sangat kompleks, inflamasi akan menggeser keseimbangan hemostasis kearah koagulasi dan jauh dari antikoagulan commit to user sebaliknya koagulasi tidak hanya terbentuk fibrin dan aktivasi trombosit tetapi juga mengakibatkan pengaktifan sel endotel vaskuler yang berperan untuk aktivasi lekosit Guntur, 2008; Suradi, 2011. Proses inflamasi secara langsung berhubungan dengan aktivasi sistem koagulasi dan fibrinolisis dengan cara mengaktifkan NF- ĸβ nuclear factor-ĸ . Interleukin-6 nampaknya sebagai sitokin utama yang melibatkan pengaktifan koagulasi dengan meningkatnya TF sedangkan TNF- α sebagian besar dilibatkan pada disregulasi jalur antikoagulasi dengan menghambat TFPI tissue factor pathway inhibitor dan AT III antithrombin III serta menekan fibrinolisis melalui peningkatan PAI-1 seperti tampak pada gambar 2.7 Guntur, 2008. Gambar 2.7. Hubungan inflamasi dengan sistem koagulasi dan fibrinolisis. dikutip dari Guntur, 2008 sitasi Levi et al., 1999 perpustakaan.uns.ac.id commit to user Balasubramaniam et al. 2012 mendukung penjelasan diatas dan menyatakan bahwa protrombosis pada DM akibat adanya disregulasi pada sistem koagulasi dan fibrinolisis, yaitu meningkatnya aktivitas sistem koagulasi yang ditandai dengan peningkatan kadar TF, F VII, trombin, tingginya kadar IL-6 dan fibrinogen, tetapi disisi lain terjadi penurunan aktivitas fibrinolisis akibat peningkatan PAI-1 Balasubramaniam et al., 2012. Penjelasan singkat hubungan DM dengan protrombosis dapat dijelaskan dengan imunopatogenesis Guntur, 2000 sebagai berikut; hiperglikemia bertindak sebagai DAMP damage associated molecular pattern akan ditangkap oleh APC antigen processing and presenting cell melalui TLR 9 toll like receptor dan akan mempresentasikannya melalui MHC II major histocompatibility complex II yang akan menggeser keseimbangan kearah Th 1 yang akan memproduksi CSF colony stimulating factor dan IFN- interferon- . CSF akan mengaktifkan netrofil, sedangkan IFN- akan mengaktivasi makrofag mengeluarkan sitokin proinflamasi seperti TNF- α, IL-1, IL-6 dan IL-8. Kondisi inilah yang disebut sebagai low grade inflamation pada DM yang akan menyebabkan disfungsi endotel sehingga terjadi peningkatan produksi TF dan PAI-1 oleh endotel seperti tampak pada gambar 2.8 Guntur, 2000. Diabetes melitus tidak hanya menyebabkan perubahan kuantitas faktor-faktor yang berpengaruh pada koagulasi dan fibrinolisis tetapi juga menyebabkan perubahan kualitas struktur jendalan clottrombus yang terbentuk. Percobaan dengan plasma- purified fibrinogen 150 pasien DM tipe 2 dibandingkan 50 kontrol sehat, ditemukan commit to user jendalanclot pasien DM lebih padat, ukuran pori-pori lebih kecil, benang fibrin lebih tebal dan percabangan lebih banyak. Hal ini karena terjadi modifikasi post translation pada fibrinogen. Akibatnya jendalanclot pada DM lebih sulit dilisiskan dibanding kontrol Alzahrani dan Ajjan, 2010. 1 LPS bp CD 14 IL 6 TNF - IL -1 IL 8 APC CD 4 + TCR IFN - SUPER ANTIGEN IL - 10 IL - 4 IL - 5 IL - 6 Ig NO ICAM -1 a g IMUNOPATOGENESIS TH - 2 TH - 1 B cell CD 8 + LPS IMUNO.COM SEPSIS MOD SHOCK SEPTIC IL-2 CSF Compl. N  NK Guntur, 2000 C3a, C5a PGE 2 TLR 4 TLR2 C7a TF- VIIA ↑ PaI- 1↑ 1 Gambar 2.8. Imunopatogenesis. dikutip dari Guntur, 2008.

2. Tissue Factor TF a. Struktur protein TF

Tissue factor disebut juga thromboplastine atau factor III; merupakan glikoprotein transmembran dengan berat molekul 47 kDa terdiri dari 263 polipeptida commit to user asam amino rantai tunggal, diklasifikasikan sebagai CD 142 reseptor sitokin klas II dengan 219 asam amino ekstraseluler N-terminus, 23 asam amino transmembran dan 21 asam amino intraseluler C-terminus Tremoli et al., 1999; Steffel et al., 2006; Monroe, 2010; Breintenstein et al., 2010; Chu, 2011. Regio ekstraseluler mengandung binding domain FVIIVIIa. Extracelluler soluble form sTF dapat dilepaskan dari sel endotel sebagai respon terhadap sitokin proinflamasi. Domain intraseluler dapat mengalami serine phosphorylation yang dapat merubah fungsinya, sebagai contoh domain sitoplasmik dapat menekan ekspresi TF akibat tertekannya fosforilasi Erk12 Chu, 2011. Gen yang bertanggung jawab untuk produksi TF terletak pada kromosom 1p21-p22, tersusun atas enam exon dan lima intron dengan panjang sekitar 12 kb kilo basa. Exon pertama untuk bagian promoter signal peptide, kedua sampai kelima untuk domain ekstraseluler sedangkan exon keenam untuk domain transmembran dan sitoplasmik Tremoli et al., 1999; Monroe, 2010. Bagian promoter memungkinkan gen ini diatur oleh rangsangan seperti pada monosit, makrofag, sel endotel ataupun produksi terus menerus seperti pada fibroblast, sel epitel. Lima Sp1 untuk produksi basal TF di banyak sel dan dua enhancer didapatkan pada bagian promoter. Proksimal enhancer untuk induksi oleh growth factor dan phorbol ester dan distal enhancer untuk induksi oleh LRE LPS responsive region yang terdiri dari dua AP-1 yang berikatan dengan c-fosc-jun heterodimer dan satu ĸβ yang akan dikenali oleh c-relp65 heterodimer, termasuk famili faktor NF- ĸ rel transcription Tremoli et al., 1999. commit to user Ekspresi TF secara terus-menerus didapatkan pada beberapa sel seperti fibroblas, otot polos dan sel epitel, tetapi pada penelitian kultur sel didapatkan hasil bahwa bagian prmoter TF dapat diinduksi oleh LPS, IL-1 β dan TNF-α Maly et al., 2007. Sitokin proinflamasi ini akan meng induksi fosforilasi IĸBα sehingga terjadi translokasi NF- ĸβ ke nucleus, berikatan dengan urutan gen DNA tertentu sehingga terjadi aktivasi trasnkripsi gen TF Tremoli et al., 1999.

b. Ekspresi TF

Tissue factor biasanya dalam bentuk inaktif encrypted dan akan teraktivasi menjadi bentuk aktif crypted bila ada kerusakan vaskuler vascular injury akibat paparan PDI protein disulfide isomerase dengan PS phosphatidylserine. Inflamasi LPS, ILs, TNF- α, CRP, C pneumoniae, IFN, MCP-1, ICAM, p-selectin, CD4040L, PDGF, oxLDL, Lpa, angiotensin II, plasmin, complement anaphylatoxin C5a, antiphospholipid antibody, AGEs dan hipoksia akan mengakibatkan upregulasi aktivasi TF Chu, 2011. Secara umum, ekspresi TF diperantarai oleh aktivasi kinase sinyal intraseluler seperti PKC, MAPK Erk, p38 dan komponen sinyal yang lain seperti faktor transkripsi AP-1, NF- ĸβ, Erg-1 Tremoli et al., 1999; Steffel et al., 2006; Breintenstein et al., 2010; Chu, 2011. Downregulasi ekspresi TF bila ada paparan HMG-CoA reduktase inhibitor, cyclooxygenase inhibitor, paclitaxel, phosphatidylcholine, nikotinamide, NO, soluble guanylate cyclase, hydroxyurea, etil piruvat, DMSO dimethyl sulfoxide, ACE inhibitor, adiponekin, retinoic acid, all trans retinoic acid, vitamin D3, PPAR α perpustakaan.uns.ac.id commit to user agonist, pentoksifilin, indobufen, phenolicsresveratrol derivative, amiodarone, metformin, peningkatan sinyal cAMP, dan PI-3KAktPKB. Short hairpin RNA, miR- 19, hairpin ribozyme dan antisense ODN menekan translasi dan ekspresi TF mRNA Chu, 2011. Sel endotel, pada kondisi fisiologis, hanya sedikit sekali mengekspresikan TF. Akan tetapi sitokin seperti TNF- α, IL-1β, CD40 ligand, biogenik amin seperti histamin, serotonin dan mediator seperti trombin, oxLDL serta VEGF dapat menginduksi ekspresi TF bila berikatan dengan reseptornya seperti tampak pada gambar 2.9. Stimulasi ini akan mengaktivasi MAPK mitogen activated protein kinase p38, ERK extracellular-signal regulated kinase dan JNK c-jun terminal kinase Steffel et al., 2006; Breintenstein et al., 2010. TNF- α, histamin dan trombin akan mengaktivasi melalui MAPK p38, ERK dan JNK, sedangkan VEGF mengaktivasi melalui MAPK p38 dan ERK. TNF- α dan VEGF juga diketahui mengaktivasi ekspresi TF melalui PKC Steffel et al., 2006 dan trombin juga mengaktivasi melalui Rho-kinase pathway Breintenstein et al., 2010. Sinyal transduksi tersebut akan mengaktivasi gen TF pada bagian promoter dengan mengaktivasi faktor transkripsi seperti AP-1, NF- ĸβ dan EGR-1, sehingga terjadi upregulasi TF mRNA Steffel et al., 2006. Dalam hal aktivasi melalui NF- ĸβ, aktivasi MAPK akan mengakibatkan degradasi protein inhibitor Iĸβ sehingga terjadi translokasi NF- ĸβ ke nukleus Breintenstein et al., 2010. commit to user Gambar 2.9. Induksi ekspresi dan aktivitas TF. dikutip dari Steffel et al., 2006. Regulasi negatif ekspresi TF dilakukan oleh PI-3K pathway, berbeda dengan MAPK dan PKC yang mengaktivasi ekspresi TF. Stimulasi sel endotel dengan TNF- α, trombin ataupun VEGF akan menginhibisi PI-3K disatu sisi tetapi justru mengaktivasi MAPK disisi lain, sehingga terjadi peningkatan ekspresi TF. Telah diketahui keterlibatan downstream target PI-3K seperti Akt dan GSK-3 β glycogen synthase kinase-3 , dimana Akt menghambat aktivasi MAPK sedangkan GSK-3 β mengatur pada tingkat transkripsi gen. Downstream target PI-3K yang lain seperti mTOR mammalian target of rapamycin dan p70S6 menghambat pada tingkat translasi TF Breintenstein et al., 2010. Mekanisme sinyal yang terlibat pada regulasi TF tampak pada gambar 2.10 dimana stimulasi MAPK p38, ERK, JNK dan PKC akan mengaktivasi pada tingkat transkripsi sehingga terjadi peningkatan TF mRNA dan selanjutnya peningkatan ekspresi TF. Sedangkan PI-3K akan menghambat ekspresi TF pada tingkat transkripsi oleh Akt dan tingkat translasi oleh mTOR dan p70S6 Breintenstein et al., 2010. perpustakaan.uns.ac.id commit to user Gambar 2.10. Mekanisme sinyal yang terlibat pada regulasi TF. dikutip dari Breintenstein et al., 2010. Tissue factor tidak hanya ditemukan pada sel vaskuler saja tetapi juga ditemukan dalam darah, yang disebut circulating atau blood-borne TF Steffel et al., 2006. Sumber blood-borne TF adalah monosit, eosinofil, platelet, MPs microparticles dan asTF alternative splicing TF. Monosit merupakan sumber utama blood-borne TF Bogdanov dan Osterud, 2010; Breintenstein et al., 2010. Vaidyula et al telah membuktikan pada sukarelawan sehat bahwa kombinasi hiperglikemia dan hiperinsulinemia pada kadar seperti DM tipe 2 akan meningkatkan ekspresi TF pada monosit dan meningkatkan interaksi antara monosit dengan platelet. Lebih lanjut juga melaporkan pada pasien DM tipe 2, terjadi peningkatan basal blood- borne TF dan TF mRNA pada monosit Bogdanov dan Osterud, 2010. commit to user Mediator proinflamasi yang berasal dari Th1 T helper type 1 seperti IFN- interferon- dan TNF- α akan menginduksi ekspresi TF pada monosit. Transformasi makrofag menjadi sel busa foam cell juga akan meningkatkan ekspresi TF. Sedangkan mediator yang berasal dari Th2 seperti IL-4, IL-10 dan IL-13 mencegah Th1 menginduksi ekspresi TF Breintenstein et al., 2010.

3. Plasminogen Activator Inhibitor – 1 PAI-1

a. Struktur protein PAI-1

Plasminogen activator inhibitor-1 adalah glikoprotein rantai tunggal dengan berat molekul ± 50 kDa yang merupakan anggota famili serpin serine proteinase inhibitor Aso, 2007. Bentuk matur yang disekresi terdiri dari 379 asam amino dan mengandung ± 13 karbohidrat. Pusat reaksi inhibisi PAI-1 terletak pada reactive centere loop RCL yang mengandung Arg 346 –Met 347 pada carboxy terminus sebagai pseudosubstrat target protease serin Binder et al., 2002; Hajjar, 2010. Serpin ini aktivitasnya tidak stabil, supaya aktivitasnya stabil maka akan membentuk komplek dengan vitronectin yang merupakan komponen plasma dan matrik periseluler Hajjar, 2010. Gen PAI-1 terletak pada lengan panjang kromosom 7 q21,3 – q22 terdiri dari sembilan ekson dengan panjang 12,2 kb kilo basa Aso, 2007; Hajjar, 2010. Terdapat dua jenis mRNA PAI-1 pada manusia dengan panjang yang berbeda, yaitu 2,3 kb dan 3,3 kb. mRNA yang panjang dengan akhiran γ’ mengandung AT-rich perpustakaan.uns.ac.id commit to user sequence , bertanggung jawab untuk stabilitas mRNA. Urutan dengan akhiran 5’ yang lebih pendek, mengandung TATA box transcription initiation site dan regulatory element, sehingga bagian ini disebut bagian promoter Binder et al., 2002; Aso, 2007.

b. Ekspresi PAI-1