Kriteria inklusi: a. DM tipe 2 usia 30-59 tahun
b. Tidak merokok c.
HbA1c ≥ 7 d. Telah menderita DM lebih dari 5 tahun
e. Menandatangani informed consent Kriteria eksklusi:
a. Riwayat AMI acute myocard infark kurang dari tiga bulan b. Menderita CHF congestive heart failure
c. Riwayat bedahtrauma kurang dari tiga bulan d. Menderita penyakit hatiginjalkeganasan
e. Pemakaian antikoagulan d. Pemakaian antilipidemia dan anti trombotik 1 bulan sebelum penelitian
4. Teknik sampling: Simple random sampling dengan program Open Epi versi 2.3.
D. Identifikasi dan Definisi Operasional Variabel
1. Variabel tergantung Tissue factor TF
Plasminogen activator inhibitor-1 PAI-1 perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
2. Variabel bebas: Simvastatin
3. Variabel perancu: Bersifat kuantitatif:
Umur, HbA1c, BMI, GDP pre, GDP post, delta GDP
Bersifat kualitatif: Jenis kelamin, lama sakit, olah raga,
insulin, OAD, hipertensi dislipidemia
4. Definisi Operasional Variabel
Parameter Definisi
Instrumen Satuan
Data Skala
Data
TF Adalah
glikoprotein yang
merupakan pemicu
kaskade koagulasi
utama dari
jalur ekstrinsik. Kadarnya meningkat
pada kondisi
inflamasi dan
disfungsi endotel sehingga mudah terjadi trombosis.
ELISA Kit: human
tissue factor chromogenic
activity, Assaypro LLC;
CT1002b pM
Rasio
PAI-1
Adalah glikoprotein
yang menghambat proses fibrinolisis.
Kadarnya meningkat pada kondisi inflamasi dan disfungsi endotel
sehingga trombus yang terbentuk tidak dapat dilisiskan.
ELISA Kit: human
PAI-1 actibind, Technoclone
GmbH; TC16075
UmL Rasio
Simvastatin Adalah obat antilipidemia dari
golongan statin, merupakan produk alamiah dari metabolit jamur,
mempunyai efek anti-oksidan dan anti-inflamasi
sehingga mampu
memperbaiki kondisi inflamasi dan disfungsi endotel. Pada penelitian
ini digunakan dosis 20 mghari. -
mg Nominal
commit to user
E. Cara Kerja
Subyek yang terpilih sebagai sampel dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok uji dan kelompok kontrol masing-masing n=12. Proses pengambilan
sampel dan membaginya menjadi dua kelompok menggunakan program komputer Open Epi versi 2.3. Selama penelitian berlangsung, regimen terapi tidak dirubah.
1. Perlakuan: a. Kelompok uji: simvastatin 20 mghari, diminum antara jam 19.00
– 22.00, selama 6 minggu.
b. Kelompok kontrol: plasebo, diminum antara jam 19.00 – 22.00, selama 6
minggu. c. Simvastatin dan plasebo dikemas dengan warna yang sama. Peneliti dan
subyek tidak mengetahui isinya, pihak ketiga bagian Farmasi yang mengetahui.
2. Monitoring: a. Dilakukan monitoring tiap dua minggu untuk mengetahui efek samping
yang timbul dengan wawancara dan pemeriksaan fisik. Dicari adanya konstipasi, flatulensie, dispepsia, nyeri abdomen, mialgia dan keluhan
lain terkait efek samping pemakaian simvastatinplasebo. b. Bila ada indikasi akan dilanjutkan dengan pemeriksaan laboratorium
seperti SGOT, SGPT, bilirubin totalIII, ureum, kreatinin dan kreatin kinase serta pemeriksaan EKG 12 lead.
commit to user
c. Indikasi untuk penghentian perlakuan bila didapatkan miopati yang nyata, peningkatan SGOTSGPT tiga kali batas atas normal dan kreatin
kinase sepuluh kali nilai teratas Krysiak et al., 2010. d. Dilakukan penghitungan jumlah obat tiap kali kontrol, dikatakan patuh
bila jumlah obat yang minum 90 – 110 Krysiak et al., 2010.
e. Selama perlakuan, subyek akan dieksklusi bila terdapat salah satu dari berikut ini; kepatuhan minum obat 80 atau 120, efek samping
serius dari obat yang diteliti dan masuk rumah sakit Tharavanij et al., 2010.
3. Tindakan bila ada efek samping: a. Penanganan efek samping sesuai indikasi.
b. Melaporkan kejadian tersebut ke Komisi Etik secepatnya. 4. Teknik pengambilan darah dan penanganan spesimen:
a. Pemeriksaan TF dan PAI-1 dilakukan sebelum dan sesudah perlakuan. b. Pemeriksaan darah tersebut dilakukan setelah puasa selama 12 jam.
c. Dilakukan pemeriksaan TF dan PAI-1 dengan mengambil sampel darah melalui vena antecubiti pada ruangan yang tenang dengan temperatur
terkontrol 24 – 25
C antara jam 08.00 – 09.00 pagi untuk menghindari
fluktuasi sirkadian kadar TF dan PAI-1.
d. Proses penanganan spesimen untuk TF, ambil darah dengan tabung sitrat sebanyak 3 cc kemudian bolak-balik perlahan-lahan 10 kali hingga
homogen. Sentrifugasi 3000 g selama 10 menit, segera pisahkan plasma perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
masukkan kedalam 3 sampel cup 0,3 cc plasma. Beri identitas, nama, tanggal dan jeins pemeriksaan. Simpan di
– 20
C stabillitas 3 bulan.
e. Proses penanganan spesimen untuk PAI-1, ambil darah dengan tabung sitrat sebanyak 3 cc kemudian bolak-balik perlahan-lahan 10 kali hingga
homogen. Sentrifugasi 2500 g selama 15 menit, segera pisahkan plasma masukkan kedalam 3 sampel cup 0,3 cc plasma. Beri identitas, nama,
tanggal dan jenis pemeriksaan. Simpan di – 20
C stabillitas 6 bulan.
f. Pemeriksaan TF dan PAI-1 dilakukan setelah semua sampel sebelum dan sesudah perlakuan terkumpul semua, untuk menghindari rusaknya kit
TFPAI-1 bila pemeriksaan dilakukan tidak secara bersamaan.
g. Pemrosesan darah untuk diambil plasmanya, penyimpanan plasma pada suhu
– 20 C dan pemeriksaan TF dan PAI-1 dilakukan dengan bekerja
sama dengan Laboratorium Klinik Prodia. Alat untuk pemeriksaan TF
dan PAI-1 dengan Microplate Reader 680 series.
5. Teknik pemeriksaan TF: a. Preparasi reagen:
1. Larutkan TF standard dengan 1,2 mL air destilasi untuk menghasilkan larutan 250 pM. Siapkan pengenceran bertingkat larutan standard
250 pM 1:2 dengan sample diluent untuk menghasilkan 125; 62,5; 31,25 dan 15,63 pM. Sample diluent digunakan sebagai zero standard
0 pM. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
Tabel 4.1. Tabel pengenceran reagen
Titik Standar Pengenceran
TF pM P1
1 bagian standar 250 pM 250,0
P2 1 bagian P1 + 1 bagian sampel diluent
125,0 P3
1 bagian P2 + 1 bagian sampel diluent 62,50
P4 1 bagian P3 + 1 bagian sampel diluent
31,25 P5
1 bagian P4 + 1 bagian sampel diluent 15,63
P6 sampel diluent
0,000
2. FVII: tambahkan dengan 1,2 mL reagent grade water. 3. FX: tambahkan 1,2 mL reagent grade water.
4. FXa substrat: tambahkan 1,1 mL reagent grade water. b. Prosedur kerja:
1. Siapkan reagen dan sampel pada suhu ruang sebelum digunakan. 2. Siapkan larutan assay mix seperti dibawah ini.
Tabel 4.2. Tabel assay mix
Reagen n=1
Assay diluent 50 μL
FVII 10 μL
FX 10 μL
3. Tambahkan 70 μL larutan assay mix diatas ke dalam setiap well.
4. Masukkan 10 μL TF standard dan sampel kedalam well. Homogenkan.
5. Tambahkan 20 μL larutan FXa substrat kedalam setiap well.
6. Baca absorbsinya pada panjang gelombang 405 nm. perpustakaan.uns.ac.id
commit to user
6. Teknik pemeriksaan PAI-1: a. Preparasi reagen:
1. Siapkan reagen dan sampel pada suhu ruang sebelum digunakan. 2. Washing buffer: larutkan 1 bagian washing buffer concentrate dengan
9 bagian air destilasi. Homogenkan. 3. Larutkan kalibrator dan kontrol dengan 200
μL air destilasi. 4. Larutkan konjugat:1 bagian konjugat dengan 50 bagian buffer.
b. Prosedur kerja: 1. Buang isi dari tiap well dan cuci dengan menambahkan 200
μL wash buffer kedalam masing-masing well. Ulangi proses tersebut sebanyak 4
kali total pencucian sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, buang isi dari well, buang sisa wash buffer dengan mengetuk-ketukkan
plate secara terbalik pada lap kertas yang bersih. 2.
Masukkan 25 μL kalibrator, kontrol kedalam well. 3.
Masukkan 75 μL larutan konjugat kedalam well. 4. Tutup well dengan plate sealer, inkubasi selama 45 menit suhu 37
o
C. 5. Lakukan pencucian seperti tahap 1.
6. Masukkan 100 μL larutan substrat kedalam well.
7. Tutup well dengan plate sealer dan inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang 20-25
o
C 8.
Masukkan 100 μL larutan stop kedalam well. 9. Baca absorbsi panjang gelombang 450 nm dalam waktu 10 menit.
commit to user
F. Teknik Analisis Data
