durham dan pastikan tidak ada udara setelah itu tutup dengan kapas.
Sterilkan alat-alat
dan tabung
reaksi dengan
menggunakan autoclave yang bertekanan 15dynecm3 1 atm dengan suhu 121
o
C.
3.8.2. Pengambilan Sampel
Warung nasi yang dipilih oleh penelitian adalah warung nasi sederhana yang berada di Kelurahan Pisangan. Keadaan warung nasi
berdasarkan kebersihanya yaitu ada beberapa yang kurang dan juga cukup baik. Kebersihan warung nasi dinilai dari sumber air yang
digunakan untuk mencuci alat makan dan cara penyajian makanan. Es batu yang telah diambil, selanjutnya dipindahkan di
wadah plastik anti panas yang sudah di sterilkan dengan autoclave. Setelah itu es batu diletakan hingga mencair pada suhu ruangan.
Pencairan es batu harus kurang dari 24 jam sebelum dilakukan uji MPN.
3.8.3. Uji MPN
Pada sampel air, digunakan teknik Most Probable Number MPN dalam pengujian untuk mendeteksi bakteri koliform. Terdapat
dua langkah dalam teknik MPN yaitu presumtive test dan confirmed test.
14
Pengujian presumtive test menggunakan seri tiga tabung dan tiga tingkat pengenceran.
3.8.3.1. Presumtive Test
Siapkan 9 tabung pyrex steril untuk satu sampel yang masing-masing diberi label. Panaskan mulut tabung lalu
masukan 10 ml Lactose Broth LB dengan menggunakan pipet ke dalam tabung lalu masukan 10 ml sampel larutan
pengenceran 10
-1
dan kocok perlahan. Panaskan mulut tabung lalu masukan 10 ml LB dengan menggunakan pipet ke dalam
tabung lalu masukan 1 ml sampel larutan pengenceran 10
-2
dan
kocok perlahan. Panaskan mulut tabung lalu masukan 10 ml LB dengan menggunakan pipet ke dalam tabung lalu masukan
0,1 ml sampel larutan pengenceran 10
-3
dan kocok perlahan. Inkubasi tabung selama 24-48 jam dengan suhu 35
C. Hasil
presumtive test dikatakan positif apalabila terdapat gas pada
tabung durham. Pengujian selalu disertai dengan kontrol positif yaitu koloni E. coli dan control negatif yaitu aquades
steril.
14
3.8.3.2.Confirmed Test
Dari tabung yang positif gas pada presumtive test dipindahkan menggunakan jarum inokulasi ke dalam media
EMBA secara aseptik. Inkubasikan pada suhu 35-37 ± 0,5 C
selama 24±2jam. Uji dikatakan positif bila terdapat koloni kehijauan dengan kilap logam.
15
3.8.4. Uji Identifikasi E. coli
3.8.4.1. Uji Biokimia IMViC
Dalam menentukan jenis bakteri E.coli maka dilakukan uji biokimia IMViC Indol, Metil merah, Voges
Praskauer dan Sitrat. 1.
Uji Indol akan terbentuk lapisan cincin berwarna merah muda pada permukaan biakan setelah p6bahan reagen
erlich. Hal
tersebut menunjukan
hasil positif
dan menguatkan kemungkinan adanya bakteri E. coli karena E.
coli merupakan bakteri yang dapat membentuk indol dari triptofan sebagai sumber karbonnya.
2. Uji methyl red, jika diduga terdapat E. coli maka hasilnya
akan positif karena terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan indikator methyl red. Artinya, bakteri
ini mengahasilkan asam campuran dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP.
