Pemeriksaan Setelah Kematian Evaluasi Uji Toksisitas

digabungkan dengan data uji biokimia sehingga dapat menggambarkan cara kerja toksikan. Ginjal merupakan organ sasaran utama dari efek toksik selain hati. Ginjal mempunyai kemampuan kompensasi yang luar biasa. Uji fungsi ginjal selain dilakukan analisis urin dan darah, juga pemeriksaan secara morfologis dan histologis. Pada pemeriksaan makroskopis ditentukan berat ginjal. Perubahan berat organ, bila dibandingkan dengan hewan pembanding, dapat menunjukkan lesi ginjal. Pemeriksaan histopatologi dapat mengungkapkan tempat, luas, dan sifat morfologik lesi ginjal. Sebagai suatu bagian vital dalam tubuh, susunan saraf dilindungi dari toksikan dalam darah oleh suatu mekanisme protektif sawar darah otak. Meskipun demikian, susunan saraf rentan dari berbagai jenis toksikan. Susunan saraf terdiri atas dua bagian utama yaitu susunan saraf perifer dan susunan saraf pusat SSP yang mencakup otak dan sum-sum tulang belakang. Pada uji toksisitas perlu juga dilakukan pemeriksaan histologi otak. Jantung adalah suatu organ yang vital dalam tubuh, meskipun bukan sasaran utama, organ ini dapat dirusak oleh berbagai senyawa, juga sistem reproduksi, testis dan vesika seminalis atau ovarium dan uterus, serta pankreas yang merupakan bagian sistem endokrin. Oleh karena itu perlu dilakukan pula pemeriksaan histologi pada organ-organ tersebut. II METODE PENELITIAN Dalam penelitian ini dilakukan pengujian toksisitas subkronis ekstrak etanol buah mengkudu dan rimpang jahe gajah tunggal serta kombinasinya. Pada tahap penelitian dilakukan penyiapan ekstrak tumbuhan obat dimulai dengan pengumpulan bahan segar berupa buah mengkudu yang cukup matang dan rimpang jahe gajah, kemudian di determinasi. Buah mengkudu dan rimpang jahe gajah dicuci dan diiris kemudian dijemur di bawah sinar matahari langsung sampai kering. Simplisia yang telah kering dihaluskan dan diayak. Setelah itu diekstraksi menggunakan pelarut etanol 96 kemudian diuapkan sampai kental. Dilakukan penetapan karakteristik ekstrak. Sediaan obat dibuat dengan melarutkan ekstrak dalam air menggunakan tragakan 1. Uji toksisitas sub kronis dilakukan menggunakan hewan tikus putih jantan dan betina galur Wistar. Diuji dengan dosis bertingkat 50, 400, 1000 mgkg bb kombinasi ekstrak etanol buah mengkudu dengan rimpang jahe gajah 1:1 dan ekstrak etanol buah mengkudu tunggal 50 mgkg bb juga ekstrak etanol rimpang jahe gajah tunggal 50 mgkg bb. Pemberian sediaan dilakukan secara oral setiap hari selama 90 hari. Kelompok satelit tetap dipelihara sampai 120 hari tanpa pemberian zat uji lagi setelah pemberian sediaan selama 90 hari. Evaluasi hasil uji toksisitas dilakukan pengamatan umum, pengamatan parameter klinik, dan pemeriksaan setelah kematian. Pada pengamatan umum dilakukan pengamatan pada penampilan, perilaku dan aktivitas motorik, serta semua abnormalitas hewan uji sebelum dan sesudah proses uji toksisitas. Berat badan dan konsumsi makanan selama proses uji toksisitas perlu diperhatikan. Konsumsi makanan yang berkurang secara nyata dapat memperberat manifestasi toksik zat uji. Hasil pengujian di laboratorium klinik diperlukan untuk membantu membuat diagnosis dan memantau toksisitas yang terjadi. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan hematologi pada darah yang diambil dari ekor tikus pada hari ke 91 dan untuk kelompok satelit pada hari ke 121, kemudian diamati jumlah sel darah merah, sel darah putih, trombosit, hemoglobin dan angka hematokrit yaitu perbandingan endapan sel dengan volume darah. Nilai parameter darah kelompok yang diberi sediaan uji dibandingkan terhadap kelompok kontrol. Dilakukan pula uji biokimia darah yang meliputi penentuan kadar glukosa, kreatinin , BUN, SGOT, SGPT, LDL, trigliserida, HDL, protein total, albumin, dan kolesterol. Analisis urin meliputi warna, berat jenis, dan pH. Pada akhir pengujian semua hewan uji yang hidup dikorbankan dan dilakukan isolasi terhadap organ-organ tertentu untuk diperiksa patologinya secara makroskopis, dilakukan pula pemeriksaan histologi. Lambung diperiksa secara makroskopis menggunakan kaca pembesar. Pada penelitian ini organ yang ditimbang dan diperiksa secara histologis yaitu hati, ginjal, kelenjar adrenal, jantung, limpa, paru-paru, otak, testes dan vesika seminalis jantan dan uterus dan ovarium betina. III PERCOBAAN 3.1 Bahan, Alat dan Hewan Uji 3.1.1 Bahan Buah mengkudu Morinda citrifolia Linn., rimpang jahe gajah Zingiber officinale Rosc., tragakan, etanol 96, air destilasi, larutan Turk 0,1, larutan natrium sitrat 2, larutan asam hidroklorida 0,1N, larutan dapar formalin, pereaksi biokimia darah, etanol absolut, xylol, paraffin padat, dan pewarna Hematoksilin Eosin HE.

3.1.2 Alat

Alat refluks, alat penguap vakum putar, cawan penguap, penangas air, timbangan analitik, timbangan tikus, mortir dan stampler, jarum oral tikus, spuit 3cc, kandang metabolisme, alat uji perilaku, tabung eppendorf, alat sentrifuga eppendorf, tabung kapiler hematokrit, mikrosentrifuga, mikropipet, hemositometer, mikroskop, alat penghitung, tabung sahli, alat bedah, spektrofotometer ultra violet visibel Fotometer 4020 Hitachi, kaca pembesar, kamera, mikrotom, kaca objek, kaca penutup, dan peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium.

3.1.3 Hewan Uji

Tikus putih jantan dan betina galur Wistar usia 2-3 bulan dengan bobot 100- 200 gram. Hewan diperoleh dari laboratorium hewan Farmakologi dan Toksikologi Sekolah Farmasi Institut Teknologi Bandung dan Pusat Antar Universitas ITB.

3.2 Penyiapan Bahan

Bahan yang digunakan adalah buah mengkudu yang diperoleh dari daerah Bandung, dan rimpang jahe gajah yang diperoleh dari daerah kadungora kabupaten garut, kemudian dilakukan determinasi tanaman di Herbarium Bandungense, Departemen Biologi Institut Teknologi Bandung. Dari hasil determinasi diperoleh data mengkudu tersebut termasuk spesies Morinda Citrifolia Linn. dan jahe gajah spesies Zingiber officinale Rosc.

3.3 Pengolahan Bahan

Buah mengkudu dan rimpang jahe gajah segar dicuci dan dibersihkan kemudian diiris dengan ketebalan lebih kurang 0,5 cm dan dijemur dibawah sinar matahari langsung sampai kering. Simplisia yang telah kering dihaluskan menggunakan alat penghancur, kemudian diayak, sehingga diperoleh serbuk simplisia yang siap digunakan untuk proses selanjutnya.

3.4 Pembuatan Ekstrak Tanaman

Ekstrak dibuat dengan menggunakan alat refluks dengan pelarut etanol 96. Serbuk simplisia ditimbang 100 gram, dimasukkan ke dalam labu bundar dan diekstraksi menggunakan 500 mL etanol 96, direfluks selama 2 jam, kemudian disaring panas-panas menggunakan kain flanel, dan disaring lagi menggunakan kertas saring sehingga didapatkan filtrat yang bening tanpa endapan. Residu diekstraksi lagi 2 kali masing-masing menggunakan 500 mL etanol 96, dan filtratnya disatukan. Seluruh filtrat yang diperoleh diuapkan menggunakan alat penguap vakum berputar sampai volumenya lebih kurang 100 mL, kemudian ekstrak diuapkan diatas penangas air pada suhu 50 o C sampai diperoleh ekstrak kental dengan bobot konstan. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran B, Gambar 3.4.

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak

Pengujian ekstrak kental meliputi parameter non spesifik yaitu susut pengeringan, bobot jenis, kadar air, kadar abu, kadar abu yang tidak larut dalam asam. Pengujian parameter spesifik meliputi organoleptik ekstrak, senyawa terlarut dalam pelarut tertentu dan kandungan kimia ekstrak termasuk flavonoid, saponin, kuinon, tanin, alkaloid, steroidtriterpenoid.

3.5.1 Parameter Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang sebanyak 2 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105 o C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5-10 mm, kemudian masukkan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105 o C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar.

3.5.2. Parameter Bobot Jenis

Digunakan piknometer bersih, kering dan telah dikaliberasi dengan menetapkan bobot piknometer pada suhu 25 o C dan bobot air yang baru dididihkan. Atur hingga suhu ekstrak cair lebih kurang 20 o C, kemudian masukkan ke dalam piknometer. Atur suhu piknometer yang telah diisi hingga suhu 25 o C, buang kelebihan ekstrak cair dan ditimbang. Kurangkan bobot piknometer kosong dari bobot piknometer yang telah diisi. Bobot jenis ekstrak cair adalah hasil yang diperoleh dengan membagi bobot ekstrak dengan bobot air, dalam piknometer pada suhu 25 o C.

3.5.3 Parameter Kadar Air

Penetapan kadar air menggunakan cara destilasi, menggunakan toluen yang telah dikocok dengan sedikit air, biarkan memisah dan buang lapisan air suling. Ke dalam labu kering dimasukkan 5 gram ekstrak kemudian dimasukkan 200 mL toluen ke dalam labu, lalu dihubungkan dengan alat destilasi. Dituangkan toluen ke dalam tabung penerima melalui alat pendingin, kemudian labu dipanaskan dengan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih, dilakukan penyulingan dengan kecepatan lebih kurang 2 tetes tiap detik, hingga sebagian air tersuling, kemudian kecepatan penyulingan dinaikkan 4 tetes tiap detik. Setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dicuci dengan toluen, sambil dibersihkan dengan sikat tabung yang disambungkan pada sebuah kawat tembaga yang telah dibasahi dengan toluen. Selanjutnya penyulingan dilakukan selama 5 menit dengan tabung penerima pendingin dibiarkan dingin pada suhu kamar. Jika ada tetes air yang melekat pada tabung pendingin pertama, dilakukan penggosokkan dengan karet yang diikatkan pada sebuah kawat tembaga dan dibasahi dengan toluen sampai tetesan turun. Setelah air dan toluen memisah sempurna dilakukan pembacaan volume air. Kemudian dilakukan penghitungan kadar air dalam persen.

3.5.4 Parameter Kadar Abu

Pada penetapan kadar abu, 2 gram ekstrak ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan