Waktu dan Tempat Penelitian

13

3.4.1 Isolasi Protein

Kacang kedelai digiling, dan diayak dengan ayakan 60 mesh. Isolasi protein sampel diawali dengan penghilangan lemak Liu et al. 2007. Sampel yang telah dihaluskan direndam dalam heksana teknis rasio 1:5 wv selama 1 jam pada suhu kamar, kemudian disentrifus 8.000 g selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapannya diekstraksi kembali sebanyak dua kali untuk menghilangkan kandungan lemak yang masih tersisa. Isolasi protein menggunakan metode pengaturan pH Speroni et al. 2010. Sampel bebas lemak dicampur dengan akuades rasio 1:10 wv, kemudian pH suspensi dinaikkan sampai 8 dengan menggunakan NaOH 1 N, diaduk selama 90 menit pada suhu ruang dan disentrifus 10.000 g selama 30 menit pada suhu 4 o C. Nilai pH supernatan yang diperoleh diturunkan sampai 4.5 dengan menggunakan HCl 1 N, lalu disentrifus selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapan proteinnya diambil dan dikeringkan dengan pengering beku. 3.4.2 Konjugasi IPK-FOS Isolat protein kedelai IPK GMO dan non-GMO digunakan sebagai model produk pangan dengan kandungan protein yang terglikasi melalui ikatan dengan gula pereduksi Fruktooligosakarida FOS. Formulasi IPK-FOS dicobakan dalam sistem pangan cair liquid berdasarkan cara kerja Van de Lagemaat 2007. Tahapan konjugasi IPK dan FOS adalah dengan cara melarutkan IPK dan FOS dalam 0.5 M buffer fosfat pH 7.4 dengan rasio molar antara lisin yang terdapat pada isolat protein kedelai dan fruktosa pada FOS yaitu 1:4; 1:14; 1:30; 1:52; dan 1:74. Campuran dituang ke dalam tabung bertutup rapat dan dipanaskan dalam water-bath bersuhu 95°C, dengan pengadukan konstan selama 1 jam. Setiap kali pengambilan, sampel didinginkan segera dalam waterbath berisi es, dilanjutkan dengan penyimpanan pada suhu -20 °C. Masing-masing perbandingan dilakukan pengujian derajat glikasi dan dipilih satu perbandingan optimal yang selanjutnya akan digunakan pada sampel. Sampel IPK GMO dan non-GMO yang telah dikonjugasi dengan FOS sesuai perbandingan optimum kemudian dianalisis derajat glikasi dan alergenisitasnya secara in vitro sehingga dapat diketahui profil respon antigenik protein IPK-FOS yang terglikasi setelah proses pengolahan dengan pemanasan. 3.4.3 Karakterisasi Kimia Konjugat IPK-FOS a. Pengukuran Glikasi Pengukuran glikasi dilakukan berdasarkan pendekatan: 1. Derajat glikasi berdasarkan banyaknya gula terikatterkonjugasi Sheikh et al. 2004 Prinsip pengujian ini dengan mereaksikan TBA dengan gugus gula yang terikat pada molekul protein yang telah terglikasi sehingga membentuk senyawa kompleks kuning kecoklatan yang dapat dibaca pada panjang gelombang 443 nm. Sebanyak 1 mL asam trikloro asetat TCA 20 ditambahkan ke dalam larutan, kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm, pencucian endapan dilakukan sebanyak 3 kali menggunakan TCA. Satu mL buffer fosfat pH= 7,4 dan 0.5 ml asam oksalat 0.3 N ditambahkan ke dalam sedimen dan disimpan dalam penangas air sampai larutan mendidih. Setelah dingin ditambahkan 1 mL TCA 40 ke dalam setiap sampel, kemudian disentrifugasi