Isolasi Protein Tahapan Kerja

14 selama 10 menit pada 3000 rpm. Supernatan dipisahkan dan ditambahkan 0.5 mL TBA 50 mmolL ke dalam 1 mL larutan supernatan tersebut, kemudian disimpan dalam penangas air dengan suhu 40°C selama 30 menit. Absorbansi sampel diukur pada 443 nm. 2. Grup amino bebas dengan metode Bradford Bradford 1976 Pengujian Bradford tergantung pada interaksi antara residu asam amino basa terutama arginin, lisin dan histidin dengan Coomassie brilliant blue G-250 CBB pada matriks asam. Ikatan CBB dengan protein akan menghasilkan warna biru. Tahapan pengujian adalah sebagai berikut: Pembuatan pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg pewarna CBB G-250 dilarutkan ke dalam 50 mL etanol 95. Selanjutnya ditambahkan 100 mL asam fosfat 85 dan ditepatkan hingga 1 L menggunakan akuades. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas Whatman No.1, lalu larutan disimpan dalam botol gelap dan pada suhu refrigerasi. Pembuatan larutan standar Deret larutan standar BSA dibuat dengan mengencerkan larutan stok BSA ke dalam tabung reaksi 1.2 x 10 cm. Kemudian ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada = 5λ5 nm setelah 5 menit. Untuk blanko, sebanyak 100 L akuades ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford dan diukur dengan cara yang sama. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel. Pengukuran sampel Sampel diambil sebanyak 100 L dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2x10 cm, lalu ditambahkan 5 mL pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada = 5λ5 nm setelah 5 menit. b. Penentuan Profil Berat Molekul Konjugat IPK-FOS berdasarkan elektroforesis SDS-PAGE Bollag dan Edelstein 1991 Elektroforesis SDS-PAGE akan memisahkan protein berdasarkan berat molekul. Protein dengan berat molekul kecil akan lebih cepat bergerak menuju anoda dibandingkan dengan protein dengan berat molekul besar. Hasil akhir adalah terbentuknya pita-pita protein pada gel akrilamid. Setiap pita menunjukkan berat molekul dari protein dan ketebalan pita menunjukkan tingkat konsentrasi protein dalam sampel. Masing-masing isolat protein kacang kedelai GMO dan non-GMO serta isolat yang terglikasi dianalisis dengan elektroforesis menggunakan gel akrilamid. Gel yang digunakan terdiri atas dua bagian, yaitu gel atas stacking gel dan gel bawah separating gel dengan konsentrasi stacking gel 5 dan separating gel 12. Adapun tahapan yang harus dilakukan dalam analisis SDS-PAGE adalah sebagai berikut: 15 Tahap I . Isolasi Protein Isolasi Protein Kacang Kedelai GMO dan non-GMO Isolat Protein Kedelai GMO dan non-GMO Parameter 1. Rendemen 2. Kadar Protein Tahap II . Konjugasi IPK-FOS Konjugasi IPK-FOS: 1:4; 1:14;1:30; 1:52; dan 1:74 dalam sistem cair IPK GMO dan non- Tahap III . Karakterisasi Kimia 1. Derajat glikasi 2. Asam amino bebas 3. Profil Berat Molekul IPK-FOS terglikasi Analisis karakteristik kimia Isolat protein kedelai GMO dan non-GMO Isolat protein kedelai GMO dan non-GMO terglikasi dengan FOS Tahap IV . Pengujian Alergenisitas 1. Kualitatif : immunoblotting 2. Kuantitatif : ELISA IPK-FOS terglikasi Pengujian Alergenisitas Karakteristik antigenik IPK GMO dan non- GMO dan IPK-FOS secara kualitatif dan kuantitatif Karakteristik kimia IPK-FOS dan IPK GMO dan non- GMO Gambar 5 Tahapan penelitian dan luaran yang diharapkan Luaran 16 Pembuatan separating gel Dua lempengan kaca mini slab yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 mL larutan A dipipet ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 2.5 mL larutan B dan 3.5 mL akuabides. Larutan tersebut kemudian diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 L APS 10 dan 5 L TEMED ditambahkan ke dalam larutan dan diaduk kembali dengan perlahan. Larutan dimasukkan ke dalam lempengan kaca mini slab tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikropipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Pembuatan stacking gel Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue . Akuabides, larutan A, dan larutan C masing-masing sebanyak 2.3 mL; 0.67 mL; dan 1.0 mL dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 L APS 10 dan 5 L TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Buffer elektroforesis dimasukkan ke wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam. Preparasi dan injeksi sampel Sebanyak 40 L sampel dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 L buffer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100°C. Sampel siap diinjeksikan sebanyak 16 L ke dalam sumur menggunakan mikropipet. Mikropipet dibilas menggunakan akuades setiap kali akan memasukkan sampel lain. Pada salah satu sumur, ditempatkan sebanyak 7 L protein marker. Standar yang digunakan adalah Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder yang mengandung 10 protein dengan berat molekul 10-260 kDa. Running SDS-PAGE Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda. Pewarnaan gel Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomasie brilliant blue G-250 kurang lebih 20 mL. Kemudian digoyanggoyangkan sesekali selama 5-10 menit. Destaining gel Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan destaining solution dan digoyangkan sesekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis. 17 Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva hubungan antara mobilitas relatif protein marker Rf dan logaritma berat molekul protein marker. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein, diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein, dan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai berikut: � = � �

3.4.4 Pengujian Alergenisitas a. Preparasi Serum Penderita Alergi Zakaria et al. 1998

Serum diambil dari seorang responden penderita alergi kacang kedelai yang telah diseleksi dari tiga penderita alergi pada penelitian sebelumnya. Responden diambil darahnya oleh tenaga medis sebanyak 20 mL. Darah segera diinkubasi pada 37°C selama 30 menit, lalu disentrifus 1250 g selama 20 menit. Sehingga diperoleh serum yang mengandung IgE antiprotein kedelai dan disimpan pada - 20°C. Untuk kontrol negatif digunakan serum dari seorang responden yang tidak menderita alergi. b. Pengujian Respon Antigenik menggunakan Immunoblotting Bollag dan Edelstein 1991 Prinsip immunoblotting adalah prinsip ikatan antigen-antibodi komplek. Protein pada membran nitroselulosa dianggap sebagai antigen. Antibodi primer serum adalah antibodi yang dapat berikatan secara spesifik dengan antigen pada nitroselulosa. Ikatan dari antigen-antibodi komplek ditandai dengan warna coklat pada antigen-antibodi tersebut. Gel hasil elektroforesis yang tidak diwarnai ditransfer ke membran nitroselulosa 0.45 µm. Gel dan membran nitroselulosa disusun dalam alat transblotting metode sandwich, lalu diisi dengan bufer. Blotting dilakukan selama 1.5 jam pada arus konstan 0.25 A. Membran dicuci dengan TBS selama 10 menit, lalu diblok dengan BSA 2 dalam TBS selama 2 jam pada suhu kamar. Membran nitroselulosa dicuci dengan TBS dan ditambah serum subyek alergi yang diencerkan 5 kali dalam TBS. Selanjutnya diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Pencucian dilakukan lagi dengan TBS, lalu diberi antibodi IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel enzim HRP pengenceran 1:3000 dalam TBS kemudian diinkubasi selama 1 jam sambil digoyang. Hasil deteksi kompleks protein alergen dengan serum subyek akan terlihat setelah diberikan substrat DAB. Deteksi positif ditandai dengan terjadinya kompleks berwarna coklat pada kertas nitroselulosa.

c. Pengujian Reaktivitas Imunologi menggunakan ELISA Rupa et al. 2008

ELISA mengukur IgE spesifik yang dapat berikatan dengan alergen dan dideteksi menggunakan antibodi yang terkonjugasi dengan enzim dan menggunakan substrat berwarna Cordle 2004. Optical Density OD kemudian diukur pada panjang gelombang 450 nm yang menunjukkan seberapa besar IgE dapat mengikat antigen. 18 Pembuatan blanko Sebanyak 200 L BSA 3 dalam PBS dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 1.5 jam pada 37°C. Selanjutnya lempeng mikrotiter dicuci 3 kali dengan PBST PBS yang mengandung 0.05 tween-20 sebanyak 200 Lsumur, lalu ditambah IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel HRP sebanyak 100 Lsumur yang sebelumnya telah diencerkan 1μ3000 dalam PBS pH 7.2. Inkubasi dilakukan selama 1 jam pada 37°C, lalu lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali, kemudian ditambah substrat DAB sebanyak 100 Lsumur, dan diinkubasi lagi selama 20 menit pada 37°C. OD diukur dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Penentuan sifat alergenisitas isolat protein kedelai Sebanyak 100 Lsumur protein sampel 100 gmL dilapiskan pada lempeng mikrotiter, kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama 18 jam dan dicuci 3 kali dengan PBST sebanyak 200 Lsumur. Selanjutnya, lempeng mikrotiter diblok dengan larutan BSA 3 dalam PBS sebanyak 200 Lsumur, dan diinkubasi selama 1.5 jam pada suhu 37°C. Setelah itu, lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali. Serum antibodi primer yang telah diencerkan 1:5 dalam PBS ditambahkan pada lempeng mikrotiter sebanyak 100 Lsumur, selanjutnya diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali. Penambahan antibodi sekunder IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel HRP dilakukan setelah mengencerkannya 1:3000 dalam PBS pH 7.2. Antibodi sekunder yang ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter sebanyak 100 Lsumur, lalu diinkubasi selama 1 jam pada 37°C, kemudian dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali dan ditambah substrat DAB sebanyak 100 Lsumur. Selanjutnya lempeng mikrotiter diinkubasi lagi selama 20 menit pada suhu 37°C. Hasil positif ditandai dengan timbulnya warna biru. Reaksi dihentikan dengan menggunakan H 2 SO 4 2 M sebanyak 50 µLsumur sehingga larutan akan berubah warna menjadi kuning. OD diukur dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Persen penurunan reaktivitas digitung dengan rumus berikut Frias et al. 2008: � = � − � � 100