Pengujian Alergenisitas a. Preparasi Serum Penderita Alergi Zakaria et al. 1998

18 Pembuatan blanko Sebanyak 200 L BSA 3 dalam PBS dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 1.5 jam pada 37°C. Selanjutnya lempeng mikrotiter dicuci 3 kali dengan PBST PBS yang mengandung 0.05 tween-20 sebanyak 200 Lsumur, lalu ditambah IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel HRP sebanyak 100 Lsumur yang sebelumnya telah diencerkan 1μ3000 dalam PBS pH 7.2. Inkubasi dilakukan selama 1 jam pada 37°C, lalu lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali, kemudian ditambah substrat DAB sebanyak 100 Lsumur, dan diinkubasi lagi selama 20 menit pada 37°C. OD diukur dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Penentuan sifat alergenisitas isolat protein kedelai Sebanyak 100 Lsumur protein sampel 100 gmL dilapiskan pada lempeng mikrotiter, kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama 18 jam dan dicuci 3 kali dengan PBST sebanyak 200 Lsumur. Selanjutnya, lempeng mikrotiter diblok dengan larutan BSA 3 dalam PBS sebanyak 200 Lsumur, dan diinkubasi selama 1.5 jam pada suhu 37°C. Setelah itu, lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali. Serum antibodi primer yang telah diencerkan 1:5 dalam PBS ditambahkan pada lempeng mikrotiter sebanyak 100 Lsumur, selanjutnya diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, lempeng mikrotiter dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali. Penambahan antibodi sekunder IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel HRP dilakukan setelah mengencerkannya 1:3000 dalam PBS pH 7.2. Antibodi sekunder yang ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter sebanyak 100 Lsumur, lalu diinkubasi selama 1 jam pada 37°C, kemudian dicuci dengan PBST 200 Lsumur sebanyak 3 kali dan ditambah substrat DAB sebanyak 100 Lsumur. Selanjutnya lempeng mikrotiter diinkubasi lagi selama 20 menit pada suhu 37°C. Hasil positif ditandai dengan timbulnya warna biru. Reaksi dihentikan dengan menggunakan H 2 SO 4 2 M sebanyak 50 µLsumur sehingga larutan akan berubah warna menjadi kuning. OD diukur dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. Persen penurunan reaktivitas digitung dengan rumus berikut Frias et al. 2008: � = � − � � 100