Glikasi dan Penurunan alergenisitas

9 melanoidin dan terbentuk advance glycation end products AGEs Liu et al. 2012. Glikasi tidak hanya dapat merubah sifat fungsional permukaan protein seperti meningkatkan kelarutannya, tapi juga mengurangi alergenisitas. Mekanisme yang bertanggung jawab atas penurunan alergenitas adalah terjadinya konjugasi antara asam amino pada protein dengan gula pereduksi sehingga akan menutupi epitop protein alergen. Denaturasi parsial selama pemanasan yang memicu glikasi dapat menyebabkan perubahan konformasi protein dan menghancurkan epitop Nakamura et al. 2008. Gambar 3 Skema reaksi Maillard Zhang dan Zhang 2007 Reaksi Maillard juga dapat meningkatkan kapasitas pengikatan IgE alergen. Asumsi ini didukung oleh fakta bahwa beberapa pasien alergi pangan hanya menunjukkan hipersensitivitas terhadap produk yang telah disimpan atau dimasak tapi tidak berpengaruh terhadap pangan mentah seperti ikan, kacang almond dan gandum. Antibodi IgE mengenali konformasi protein epitop konformasi atau urutan peptida sekuen epitop alergen. Glikasi pada alergen dengan reaksi Maillard diduga meningkatkan reaktivitas IgE alergen tersebut, atau bahkan membuat IgE epitop baru. Beberapa studi melaporkan bahwa ekstrak protein dari kacang goreng menunjukkan reaktivitas IgE lebih tinggi daripada kacang mentah Toda et al. 2014. 10 Gambar 4 Struktur fruktooligosakarida Eurofins 2015 Tabel 3 Pengaruh konjugasi protein terhadap alergenisitas Peneliti Protein Konjugat Hasil Van de Lagemaat et al. 2007 Isolat Protein Kedelai -FOS -Fruktosa - Penambahan gula pereduksi mengakibatkan glikasi -Glikasi baik kering maupun basah menurunkan sifat antigenisitas Nakamura et al. 2008 Fag e 1 asal buckwheat - Arabinogaktikan - Xyloglukan Konjugasi menurunkan reaktivitas alergen mayor pada buckwheat serta meningkatkan kelarutan Ilchmann et al. 2010 Ovalbumin OVA Glukosa Glikasi OVA meningkatkan imunogenisitas sel T alergen yang ditunjukkan dengan meningkatnya aktivasi sel T CD4+ Bielikowicz et al. 2010 Protein gandum Glukosa Menurunkan asam amino bebas dan imunoreaktivitasnya Kaburaki et al. 2011 Cry j 1 asal serbuk sari CpG oligodeoxynucleo tides Menghambat respon IgE terhadap allergen serbuk sari yang diimunisasikan ke tikus Cucu et al. 2012 Protein hazelnut Glukosa Konjugasi melalui reaksi Maillard menurunkan aktivasi basofil 11 Gula pereduksi yang dapat digunakan pada reaksi glikasi salah satunya adalah Fruktooligosakarida FOS. FOS merupakan substansi karbohidrat dari famili fruktan, terdiri dari bermacam-macam gugus polimer fruktosa. Zat ini terdapat pada berbagai jenis tanaman yang disimpan sebagai karbohidrat oleh tanaman. Dalam penggolongan serat pangan, FOS termasuk dalam serat fungsional karena memiliki efek fisiologis yang berguna bagi kesehatan manusia. FOS mengandung campuran oligomer dan polimer -2-1-fruktosa. Karena adanya konfigurasi pada monomer fruktosa, FOS tidak dapat dihidrolisis oleh enzim pencernaan usus halus Ratna dan Savitri 2011. Formula umum dari FOS adalah GFn dimana G adalah Glukosa, F adalah Fruktosa dan n adalah jumlah polimer antara 2 – 10 Kusumawati dan Noor 2005. Struktur FOS disajikan dalam Gambar 4. FOS adalah suatu senyawa kimia yang termasuk prebiotik. Prebiotik adalah komponen pangan yang tidak dapat dicerna oleh enzim-enzim pada pencernaan manusia dan berperan secara selektif dalam menstimulasi pertumbuhan mikroflora yang menguntungkan, sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen yang terdapat di dalam usus Tri et al. 2010. FOS juga dapat digunakan baik untuk meningkatkan nilai gizi atau memperbaiki sifat organoleptik produk. FOS sering digunakan sebagai pengganti gula Padma dan Prabhasankar 2013. Selain manfaat-manfaat tersebut, FOS dapat digunakan untuk dikonjugasikan dengan protein melalui reaksi Maillard sehingga dapat menurunkan sifat alergenisitas protein tersebut. FOS memiliki kemampuan untuk mereduksi sehingga dapat ikut berperan dalam reaksi Maillard Mesa et al. 2008. Pengaruh konjugasi protein terhadap alergenisitas disajikan pada Tabel 3. 12 3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari Mei 2014 sampai April 2015 di Laboratorium Kimia Pangan, Laboratorium Biokimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan FATETA-IPB, laboratorium bioteknologi Seafast Center LPPM-IPB dan laboratorium Bioteknologi Pusat Studi Satwa Primata IPB.

3.2 Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kedelai GMO Tiga Roda Super dan non-GMO SBB Food yang diperoleh dari Koperasi Produsen Tahu Tempe Indonesia KOPTI, FOS fruktooligosakarida komersial Orafti ® P95, serta darah yang diambil dari responden penderita alergi kacang. Bahan kimia yang digunakan antara lain adalah heksana teknis, NaOH Merck, K 2 HPO 4 Merck, KH 2 PO 4 Merck , HCl 38.0 Merck, amonium perisulfat APS Sigma, asam oksalat 99.5 Merck, asam trikloroasetat 99.9 TCA 641730-500GM Merck, asam tiobarbiturat 1081800025 TBA Merck, methanol Pa Merck, etanol 95 Merck, asam fosfat Merck, asam asetat glacial Merck, akuades, tween-20, TEMED N,N,N’,N’-tetramethyl-ethane-1,2- diamine Merck, tris base Trihydroxymethylaminomethane Sigma, SDS sodium dodecyl sulphate Merck, N,N-metilen-bisakrilamid BIO-RAD, BSA bovine serum albumin, akrilamid BIO-RAD, glisin Merck, TBS tris buffer saline Sigma, PBS phosphate buffer saline Sigma, akuades, akuabides, coomasie brilliant blue G-250 Merck, antibodi IgG tikus anti IgE manusia yang berlabel enzim HRP Horseradish Peroxydase ICL Lab, ME-80P-24A, substrat DAB 3,3’ Diaminobenzidine Sigma-Aldrich, Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder yang mengandung 10 protein dengan berat molekul 10-260 kDa Thermo Scientific, 26634 .

3.3 Alat

Peralatan yang digunakan adalah alat sentrifuse, SDS-PAGE BIO-RAD, lempeng mikrotiter datar polistiren 96 well Nunc Maxisorb, ELISA reader BIO-RAD, spektrofotometer UV-160, Shimadzu Japan, water bath GFL D- 30938, Germany, inkubator Memmert, membran nitroselulosa 0.45 µm BIO- RAD untuk immunoblotting, timbangan analitik KERN, pH meter Eutech Instrument, vortex Stuart Scientific, stirrer Cimarec, tabung Eppendorf, mikropipet, kertas saring Whatman no. 1, Sentrifus Eppendorf Centrifuge 5810 R dan peralatan gelas lainnya.

3.4 Tahapan Kerja

Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap yang secara garis besar dapat dilihat pada Gambar 5 dengan tahapan sebagai berikut: 13

3.4.1 Isolasi Protein

Kacang kedelai digiling, dan diayak dengan ayakan 60 mesh. Isolasi protein sampel diawali dengan penghilangan lemak Liu et al. 2007. Sampel yang telah dihaluskan direndam dalam heksana teknis rasio 1:5 wv selama 1 jam pada suhu kamar, kemudian disentrifus 8.000 g selama 15 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapannya diekstraksi kembali sebanyak dua kali untuk menghilangkan kandungan lemak yang masih tersisa. Isolasi protein menggunakan metode pengaturan pH Speroni et al. 2010. Sampel bebas lemak dicampur dengan akuades rasio 1:10 wv, kemudian pH suspensi dinaikkan sampai 8 dengan menggunakan NaOH 1 N, diaduk selama 90 menit pada suhu ruang dan disentrifus 10.000 g selama 30 menit pada suhu 4 o C. Nilai pH supernatan yang diperoleh diturunkan sampai 4.5 dengan menggunakan HCl 1 N, lalu disentrifus selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang, sedangkan endapan proteinnya diambil dan dikeringkan dengan pengering beku. 3.4.2 Konjugasi IPK-FOS Isolat protein kedelai IPK GMO dan non-GMO digunakan sebagai model produk pangan dengan kandungan protein yang terglikasi melalui ikatan dengan gula pereduksi Fruktooligosakarida FOS. Formulasi IPK-FOS dicobakan dalam sistem pangan cair liquid berdasarkan cara kerja Van de Lagemaat 2007. Tahapan konjugasi IPK dan FOS adalah dengan cara melarutkan IPK dan FOS dalam 0.5 M buffer fosfat pH 7.4 dengan rasio molar antara lisin yang terdapat pada isolat protein kedelai dan fruktosa pada FOS yaitu 1:4; 1:14; 1:30; 1:52; dan 1:74. Campuran dituang ke dalam tabung bertutup rapat dan dipanaskan dalam water-bath bersuhu 95°C, dengan pengadukan konstan selama 1 jam. Setiap kali pengambilan, sampel didinginkan segera dalam waterbath berisi es, dilanjutkan dengan penyimpanan pada suhu -20 °C. Masing-masing perbandingan dilakukan pengujian derajat glikasi dan dipilih satu perbandingan optimal yang selanjutnya akan digunakan pada sampel. Sampel IPK GMO dan non-GMO yang telah dikonjugasi dengan FOS sesuai perbandingan optimum kemudian dianalisis derajat glikasi dan alergenisitasnya secara in vitro sehingga dapat diketahui profil respon antigenik protein IPK-FOS yang terglikasi setelah proses pengolahan dengan pemanasan. 3.4.3 Karakterisasi Kimia Konjugat IPK-FOS a. Pengukuran Glikasi Pengukuran glikasi dilakukan berdasarkan pendekatan: 1. Derajat glikasi berdasarkan banyaknya gula terikatterkonjugasi Sheikh et al. 2004 Prinsip pengujian ini dengan mereaksikan TBA dengan gugus gula yang terikat pada molekul protein yang telah terglikasi sehingga membentuk senyawa kompleks kuning kecoklatan yang dapat dibaca pada panjang gelombang 443 nm. Sebanyak 1 mL asam trikloro asetat TCA 20 ditambahkan ke dalam larutan, kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm, pencucian endapan dilakukan sebanyak 3 kali menggunakan TCA. Satu mL buffer fosfat pH= 7,4 dan 0.5 ml asam oksalat 0.3 N ditambahkan ke dalam sedimen dan disimpan dalam penangas air sampai larutan mendidih. Setelah dingin ditambahkan 1 mL TCA 40 ke dalam setiap sampel, kemudian disentrifugasi