imunositokimia dengan LMP1. Tampilan dari LMP1 dievaluasi, ditabulasi dan dibandingkan berdasarkan klasifikasi diagnosis karsinoma nasofaring dan dibuat
dalam bentuk tabel. Data tersebut kemudian diolah dan dianalisis secara statistik.
3.8.1. Prosedur pengambilan sampel sitologi dengan sibajah
Peralatan yang digunakan adalah pistolet Comeco, disposable spuit 10 ml, ukuran jarum 22-23 G, kapas alkohol dan plesterin penutup luka.
a. Kulit didesinfeksi tanpa menggunakan anestesi. Nodul KGB difiksasi dengan jari tangan sambil kulit di atasnya diregangkan.
b. Apabila jarum sudah berada di dalam nodul, piston ditarik ke arah proksimal dan tekanan di dalam tabung menjadi negatif dan aspirat
mengandung sejumlah sel masuk ke dalam lumen jarum atau tabung suntik.
c. Apabila aspirat telah terlihat pada muara jarum pegangan piston dilepaskan sehingga tekanan dalam tabung kembali seperti semula
d. Jarum dibebaskan dari tabung suntik, piston ditarik ke arah proksimal, jarum disatukan kembali, sehingga ruangan tabung bertekanan positif.
Lalu ujung jarum diletakkan pada kaca objek, piston didorong secara hati-hati dan aspirat diteteskan di atas kaca objek dan dibuat sediaan
hapus. Untuk mengosongkan jarum atau tabung, prosedur ini dapat dilakukan berulang-ulang.
e. Sediaan hapusan segera direndam dalam alhohol 95 selama 1 menit kemudian dikeringkan di udara.
Universitas Sumatera Utara
3.8.2. Prosedur pewarnaan sampel dengan Papanicolaou
Pewarnaan menurut Papanicolaou pada penelitian ini menggunakan Papanicolaou Staining Kit produksi Merck, yang terdiri atas pewarnaan
Papanicolaou standar berupa Gill 2 Hematoxyllin, EA-50 dan Orange G-6. Zat aktif yang terdapat pada cairan pewarna antara lain:
a Gill 2 Hematoxillin: Aluminium sulfate
3,3 Hematoxillin
0,376 b Bluing reagent:
Sodium bicarbonate 0,18
Lithium carbonate 0,85
c Orange-G-6: Orange
–G 0,67
Phosphotungstic acid 0,02
d EA-50: Eosin-Y
0,45 Phosphotungstic acid
0,2 Light Green SF Yellowish
0,1 e Shandon Mounting Medium:
Methacrylate polymer 30,8
Prosedur pewarnaan Papanicolaou dimulai dengan meletakkan slaid sediaan hapusan pada wadah pertama pada nampan berisi alkohol 95 disebelah
tanda panah berkode ”start” yang terletak di pojok kiri bawah nampan. Langkah
Universitas Sumatera Utara
selanjutnya dengan mengikuti arah tanda panah sebanyak 18 langkah sebagai berikut:
1. Slaid direndam dalam wadah alkohol 95 selama 1 menit 2. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95 sebanyak 10 kali
celupan 3. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah air suling sebanyak 10 kali celupan
4. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan Hematoxyllin Gill 2 selama 1 menit
5. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah air suling sebanyak 10 kali celupan 6. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan Bluing Reagent selama 1 menit
7. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah air suling sebanyak 10 kali celupan 8. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95 sebanyak 10 kali
celupan 9. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan Orange-G-6 selama 1 menit
10. Kemudian slaid dicelup dalam wadah alkohol 95 sebanyak 10 kali celupan
11. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95 sebanyak 10 kali celupan
12. Selanjutnya slaid direndam dalam larutan EA-50 selama 1 menit 13. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95 sebanyak 10 kali
celupan 14. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 95 sebanyak 10 kali
celupan
Universitas Sumatera Utara
15. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 100 sebanyak 10 kali celupan
16. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah alkohol 100 sebanyak 10 kali celupan
17. Selanjutnya slaid dicelup dalam wadah Xylene sebanyak 10 kali celupan 18. Terakhir slaid direndam dalam larutan Xylene selama 1 menit
19. Tutup slaid menggunakan Shandon Mounting Medium.
3.8.3. Prosedur pewarnaan sampel dengan imunositokimia LMP1
Slaid yang telah diwarnai sebelumnya dengan pewarnaan rutin direndam dalam larutan asam alkohol selama 5-10 menit untuk melunturkan warna sehingga
preparatsediaan hapusan siap untuk diwarnai dengan imunositokimia. 1. Destaining X
ylol I, Xylol II, Xylol III………………….. 5 menit 2. Rehidrasi dalam etanol dengan gradasi menurun Alkohol absolut,
alkohol 96, alkohol 80, alcohol 70………………… 4 menit 3.
Cuci dengan air mengalir…………………………………….. 5 menit 4. Blocking Endogen Peroksida 0,5 Methanol 100 ml+ H2O2 1,6
ml…………………………………………………………..30 menit 5. Cuci dengan air mengalir
……………………………………… 5 menit 6. Masukkan slaid dalam larutan target retrieval untuk pretreatment
dengan TRIS-EDTA dan dipanaskan cook 1-2, microwave … 10 menit.
7. Didinginkan selama ± 30 menit. 8. Cuci dalam PBS ph 7,4
………………………………………. 3 menit. 9. Tandai populasi sel dengan Pap pen.
Universitas Sumatera Utara
10. Blocking dengan Normal Horse Serum 5........................... 15 menit 11. Inkubasi dengan antibodi primer anti-EBV Latent Membrane Protein
1 antibody, ab7502 dalam temperatur kamar ……………….. 60 menit
12. Cuci dalam PBS ph 7,4 ……………………………………….. 3 menit.
13. Teteskan Universal- link………………………………………….. 15 menit.
14. Cuci dalam PBS ph 7,4 ………………………………………. 3 menit.
15. Teteskan Trekavidin- HRP Label…………………………….. 15 menit.
16. Cuci dalam PBS ph 7,4 ………………………………………. 3 menit.
17. Teteskan larutan diaminobenzidine DAB+Substrat Buffer, 2-5 menit. 18. Cuci dengan air mengalir
……………………………………... 5 menit. 19. Counterstain dengan hematoxylin
………………………………… 5 menit. 20. Cuci dengan air mengalir
……………………………………… 5 menit 21. Masukkan ke dalam larutan Litium karbonas jenuh 5 dalam
akuades ……………………………………………………….. 2 menit.
22. Cuci dengan air mengalir ……………………………………… 5 menit
23. Dehidrasi dalam etanol dengan gradasi bertingkat 80, 96, absolut, absolut
…………………………………………………… 5 menit. 24. Clearing
Xylol I, Xylol II, Xylol III…………………… 5 menit. 25. Mounting + cover glass
26. Lihat tampilan imunositokimia LMP1 di bawah mikroskop..
.
3.9. Alat dan Bahan Penelitian 3.9.1. Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian ini adalah : pistolet Cameco, disposable spuit 10 ml, ukuran jarum 22-23G panjang 30-50 mm, kapas alkokol,
Universitas Sumatera Utara
inkubator, staining jar, rak kaca objek, kaca objek, rak inkubasi, pensil Diamond, pipet mikro, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung
sentrifus 15 ml, microwave, spin master, thermolyte stirrer, entelan, deck glass dan mikroskop cahaya.
3.9.2. Bahan Penelitian
