BAB III METODOLOGI
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Lingkungan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup, Institut Pertanian Bogor PPLH IPB. Penelitian ini
berlangsung mulai dari bulan Maret 2011 sampai bulan Agustus 2011.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam persiapan bibit yaitu polybag, kertas koran, kardus, gunting stek, paranet dan plastik. Dalam pembuatan media, alat-
alat yang digunakan yaitu gelas piala, gelas ukur biasa, pipet volumetrik, neraca analitik, pH meter, panci, pengaduk, autoklaf, karet gelang dan plastik. Sedangkan
alat-alat yang digunakan dalam kegiatan sterilisasi dan penanaman yaitu spatula, cawan petri, skalpel, pisau, pinset, lampu bunsen, laminar air flow cabinet,
stopwatch, aluminium foil, plastik wrap dan handsprayer; serta alat tulis dan
kamera digital untuk kegiatan pengamatan.
Bahan yang digunakan dalam persiapan bibit yaitu kompos, pasir, sekam padi, serbuk gergaji dan cocopeat. Dalam kegiatan sterilisasi dan penanaman,
bahan-bahan yang digunakan yaitu fungisida, bakterisida, hormon tunas, Hyponex hijau, alkohol 70, deterjen, air steril, HgCl
2
, Clorox, antiseptik betadine dan eksplan tumih bagian pucuk, sedangkan dalam pembuatan media, bahan-bahan
yang diperlukan yaitu larutan stok media MS Murashige dan Skoog, agar-agar, gula pasir, air steril, antibiotik ppm, BAP 6-benzyl amino purine dan TDZ
Thiadiazuron.
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Persiapan Bibit Tumih
Anakan tumih diambil dengan menggunakan metode puteran dan cabutan. Lokasi pengambilan anakan tumih yaitu Kelurahan Kereng Bangkirai, Kecamatan
Sabangau, Propinsi Kalimantan Tengah. Kriteria pengambilan anakan tumih yaitu anakan yang memiliki tinggi 10 cm hingga 50 cm, pucuk yang masih menguncup,
anakan yang belum memiliki kayu dan memiliki pertumbuhan yang baik.
Pengambilan anakan tumih dengan metode puteran dilakukan dengan mengeruk anakan sehingga akar dan tanah menjadi satu, kemudian anakan
dimasukkan ke dalam polybag. Setelah itu, polybag yang berisi anakan dimasukkan dalam plastik besar kemudian diberi air gambut hingga menutupi
seperempat bagian polybag, lalu ditutup sampai rapat sehingga air tidak dapat keluar dan dimasukkan ke dalam kardus. Sedangkan anakan tumih yang diambil
dengan metode cabutan dilakukan dengan mencabut anakan dan memisahkan tanah dari akar anakan, kemudian anakan dibungkus menggunakan kertas koran.
Anakan yang telah dibungkus kertas koran dimasukkan ke dalam plastik besar dan diberi air gambut sampai kertas koran menjadi lembap serta dimasukkan dalam
kardus. Anakan tumih yang diambil dengan metode puteran dan cabutan
dipindahkan ke media tanam yang telah disediakan sebelumnya di Rumah Kaca Ekologi Hutan, Fakultas Kehutanan IPB. Anakan yang diambil dengan metode
puteran langsung dipindahkan ke media tanam di dalam polybag. Pada anakan dengan metode cabutan, dilakukan pengurangan daun sehingga tersisa sepertiga
daun. Tujuan dari pemotongan daun untuk mengurangi penguapan dari tanaman tersebut. Pemotongan dilakukan dengan menggunakan gunting stek yang telah
disterilisasi menggunakan alkohol 70. Anakan yang telah dipindahkan diberi sungkup UV dan paranet 65 yang bertujuan untuk menjaga suhu, kelembapan
dan intensitas cahaya.
3.3.2 Karantina Tanaman
Karantina dilakukan untuk mensterilisasi tanaman dari kontaminan berupa
jamur atau bakteri yang berasal dari alam. Proses karantina yang dilakukan yaitu dengan menyemprot hormon tunas 10 mll atau Hyponex hijau 2 gl pada pagi
hari. Pada sore hari disemprot fungisida Antracol 1 gl + bakterisida Agrept 1 gl. Dalam pelaksanaannya, proses sterilisasi hanya dilakukan satu kali dalam
seminggu. Hal ini dikarenakan kondisi bibit yang belum stabil serta menghindari kematian bibit tumih.
3.3.3 Sterilisasi
Proses sterilisasi dalam kegiatan kultur jaringan terdiri dari sterilisasi
lingkungan kerja, sterilisasi alat dan medium kultur, serta sterilisasi eksplan.
Sterilisasi lingkungan kerja untuk kultur in vitro terdiri dari lingkungan umum ruang transfer secara keseluruhan dan lingkungan khusus lingkungan di dalam
laminar air flow cabinet. Steriliasi alat-alat kerja yaitu pinset, skalpel, gunting dan botol kultur
dicuci menggunakan deterjen sampai bersih kemudian dikeringkan. Alat-alat tersebut dibungkus menggunakan kertas koran kemudian diautoklaf selama satu
jam pada suhu 121 ⁰C sampai 126⁰C dan tekanan 1,5 atm. Alat-alat yang telah
diautoklaf dimasukkan ke dalam laminar air flow cabinet untuk disinari ultraviolet UV. Sterilisasi pada laminar air flow cabinet yaitu dengan
menyemprot permukaan atau meja kerja dengan alkohol 70 dan menghidupkan blower pada laminar air flow cabinet. Lampu ultraviolet dalam laminar air flow
cabinet dinyalakan selama satu hingga dua jam sebelum melakukan kegiatan di laminar air flow cabinet, ini bertujuan untuk mengurangi kontaminan di tempat
kerja. Pinset dan mata pisau yang digunakan pada proses inisiasi dicelupkan ke dalam alkohol 70 dan dibakar di atas api bunsen untuk menjaga sterilitas
sebelum kegiatan pemotongan dan penanaman eksplan. Media kultur yang digunakan disterilkan menggunakan autoklaf selama 20
menit pada suhu 121 ⁰C sampai 126⁰C dengan tekanan 1,5 atm. Untuk mengetahui
perubahan atau kontaminasi yang terjadi sebelum digunakan, media perlu disimpan selama dua hingga tiga hari.
Perlakuan sterilisasi yang dilakukan merupakan perlakuan yang dianggap optimal berdasarkan literatur dikarenakan jumlah eksplan yang terbatas. Proses
sterilisasi eksplan yang dilakukan yaitu sterilisasi di luar dan di dalam laminar air flow cabinet. Proses sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet yaitu:
1. Anakan tumih yang telah dikarantina, diambil pucuk yang masih menguncup
dari bahan induk dengan panjang 1-2 cm. 2.
Eksplan pucuk yang telah dipotong dari bahan induk dicuci bersih pada air mengalir dan diusap dengan kapas basah untuk menghilangkan kotoran yang
menempel. 3.
Pencucian eksplan dengan deterjen sebanyak sepertiga sendok spatula selama 10 menit, kemudian eksplan dicuci bersih.
4. Eksplan dibilas dengan menggunakan air steril sebanyak dua kali masing-
masing 5 menit. Proses sterilisasi lanjut di dalam laminar air flow cabinet yaitu pencucian
eksplan menggunakan air steril sebanyak satu kali selama 5 menit. Setelah itu, eksplan direndam menggunakan larutan HgCl
2
0,1 gram100 ml 20 selama 7 menit. Selanjutnya, perendaman eksplan dilakukan menggunakan Clorox 5
selama 3 menit, kemudian perendaman eksplan dengan larutan betadine 10 tetes100 ml selama 5 menit. Eksplan yang telah direndam dengan betadine dibilas
menggunakan air steril sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit.
3.3.4 Pembuatan Media Kultur
3.3.4.1 Pembuatan Larutan Stok
Pembuatan media dasar kultur yaitu membuat larutan stok yang terdiri atas larutan stok A, larutan stok B, larutan stok C, larutan stok D, larutan stok E,
larutan stok F, stok myo-inositol, stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh. Masing-masing unsur pembentuk larutan stok ditimbang kemudian dilarutkan ke
dalam air steril sebanyak satu liter dan disimpan di tempat bertemperatur rendah lemari es. Komposisi masing-masing larutan stok dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3 Komposisi masing-masing larutan stok
No. Larutan Stok
Rumus Kimia Komposisisenyawa
Konsentrasi MS g200 ml
1 Stok A
Amonium Nitrat NH
4
NO
3
66 2
Stok B Kalium Nitrat
KNO
3
76 3
Stok C Kalium Dihidrogen Fosfat
Asam Borat Kalium Iodida
Natrium Molibdat Kobalt Klorida
KH
2
PO
4
H
3
BO
3
Kl Na
2
MoO
4
. 2H
2
O CoCl
2
. 6H
2
O 6,8
0,25 0,03
0,01 0,01
4 Stok D
Kalsium Klorida CaCl
2
. 2H
2
O 1,76
5 Stok E
Magnesium Sulfat Mangan Sulfat
Zink Sulfat Tembaga Sulfat
MgSO
4
. 7H
2
O MnSO
4
. 4H
2
O ZnSO
4
. 4H
2
O CuSO
4
. 5H
2
O 1,48
0,89 0,34
0,01
6 Stok F
Na
2
EDTA Besi II Sulfat
C
10
H
14
N
2
Na
2
O
8
. 2H
2
O FeSO
4 .
7H
2
O 1,11
1,49 7
Vitamin Nicotinic Acid
Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl
Glycine C
6
H
6
N
2
O C
8
H
11
NO
3
. HCl C
12
H
17
N
4
OS. HCl C
2
H
5
NO
2
0,02 0,02
0,04 0,08
8 Myo-inositol
Myo-inositol 4
Sumber : Murashige dan Skoog 1962 dalam Zulkarnain 2009
3.3.4.2 Pembuatan Media MS dengan Antibiotik ppm
Tahapan yang dilakukan selanjutnya setelah pembuatan larutan stok adalah pembuatan medium MS Murashige and Skoog dengan antibiotik ppm.
Langkah-langkah pembuatan media MS dengan antibiotik ppm yaitu sebagai berikut :
1. Memasukkan larutan stok A, B, C, D, E, F, myo-inositol masing-masing 5 ml,
vitamin 2 ml dan antibiotik ppm sebanyak 1 ml ke dalam gelas piala. 2.
Menambahkan gula pasir sebanyak 30 gram dan aquades sehingga volume menjadi 1000 ml.
3. Mengukur kadar pH larutan yang berkisar antara pH 5 - 6. Jika pH 5 maka
ditambahkan larutan NaOH secara bertahap sehingga media mencapai pH 5 - 6 dan jika pH 6 maka ditambahkan larutan HCl secara bertahap sehingga
media mencapai pH 5 - 6. 4.
Memasukkan agar-agar bubuk sebanyak 6 gram ke dalam larutan dan diaduk hingga rata kemudian larutan media dimasukkan dalam panci dan dimasak
hingga mendidih. 5.
Media yang telah mendidih dimasukkan dalam botol kultur dengan ukuran masing-masing 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan
plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. 6.
Botol yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
o
C sampai 126
o
C dan tekanan 1,5 atm. 7.
Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol 70 kemudian disimpan di dalam lemari
dengan suhu ruangan.
3.3.4.3 Pembuatan Media Perlakuan
Pada media perlakuan, ditambahkan BAP dan TDZ sesuai konsentrasi yang telah ditentukan. Pembuatan media perlakuan ini diawali dengan proses yang
sama pada pembuatan media kontrol MS + ppm 1 ml. Penambahan BAP dan
TDZ dilakukan sebelum pengenceran dengan air aquades hingga menjadi volume akhir satu liter. Larutan yang telah diencerkan diukur kadar pH nya menggunakan
pH meter, sehingga diperoleh kisaran pH yang umum digunakan yaitu pH 5 - 6. Setelah itu, larutan yang memiliki kadar pH 5 - 6 dituang ke dalam panci
kemudian dicampurkan agar-agar. Larutan yang telah tercampur agar-agar dimasak hingga mendidih dan dituang ke dalam botol-botol kultur yang telah
steril masing-masing sebanyak 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. Botol
yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
o
C sampai 126
o
C dan tekanan 1,5 atm. Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol
70 kemudian disimpan di dalam lemari dengan suhu ruangan.
3.3.5 Penanaman
Cawan petri yang akan digunakan untuk penanaman, terdiri dari dua macam yaitu cawan petri berukuran kecil yang berisi tissue dan cawan petri
berukuran besar. Cawan petri berukuran kecil dan berukuran besar terlebih dahulu disterilisasi menggunakan autoklaf dan cawan petri tersebut dimasukkan ke
laminar air flow cabinet. Untuk peletakan eksplan dilakukan dengan dua cara yaitu cawan petri yang berukuran kecil bertujuan untuk mengurangi air yang
menempel pada eksplan sedangkan cawan petri berukuran besar bertujuan untuk memotong eksplan yang berukuran 1-2 cm. Pemotongan eksplan dilakukan pada
bagian eksplan yang luka dan terkena bahan sterilan. Potongan eksplan kemudian ditanam pada media kultur. Botol kultur yang telah ditanam eksplan ditutup rapat
dengan menggunakan aluminium foil dan plastik kemudian diikat dengan karet dan dilapisi dengan plastik wrap. Setelah tahap inisiasi, botol kultur yang telah
berisi eksplan diletakkan di ruang kultur yang suhu dan cahaya telah diatur. Cahaya yang digunakan pada pagi hingga sore hari yaitu dari pantulan cahaya
matahari, sedangkan pada sore hingga malam hari menggunakan cahaya lampu.
3.3.6 Pengamatan
Pengamatan terhadap hasil inisiasi dilakukan selama 4 minggu setelah tanam MST, setiap 1 minggu sekali. Adapun parameter yang diamati adalah :
1. Persentase rata-rata eksplan tumih yang hidup ditandai dengan eksplan yang
berwarna kehijauan 2.
Persentase rata-rata eksplan yang mengalami kontaminasi ditandai dengan munculnya kontaminan berupa jamur dan bakteri
3. Persentase rata-rata eksplan yang mengalami pencokelatan browning
Total perlakuan yang diamati berjumlah 16 perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari 7 ulangan sehingga secara keseluruhan terdapat 112 satuan percobaan.
Interaksi antar faktor dari percobaan yang dilakukan dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Interaksi faktor jenis zat pengatur tumbuh dan konsentrasinya
Keterangan : A0 : BAP konsentrasi 0 mll
B0 : TDZ konsentrasi 0 mll A1 : BAP konsentrasi 0,5 mll
B1 : TDZ konsentrasi 0,05 mll A2 : BAP konsentrasi 1 mll
B2 : TDZ konsentrasi 0,1 mll A3 : BAP konsentrasi 1,5 mll
B3 : TDZ konsentrasi 0,5 mll
3.4 Analisis Data
Perhitungan meliputi persentase peluang hidup, kontaminasi oleh jamur dan bakteri serta pencokelatan pada eksplan menggunakan rumus sebagai berikut :
Peluang Hidup =
Σ eksplan yang memiliki peluang hidup x 100 N
Kontaminasi =
Σ eksplan terkontaminasi x 100 N
Pencokelatan =
Σ eksplan mengalami pencokelatan x 100 N
Keterangan : N = Jumlah total eksplan tiap perlakuan
Zat Pengatur Tumbuh dan Konsentrasinya
B0 B1
B2 B3
A0 A0B0
A0B1 A0B2
A0B3 A1
A1B0 A1B1
A1B2 A1B3
A2 A2B0
A2B1 A2B2
A2B3 A3
A3B0 A3B1
A3B2 A3B3
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Peluang Hidup Eksplan Tumih
Jumlah eksplan tumih yang ditanam sebanyak 112 eksplan yang telah diinisiasi pada media kultur dan diamati selama 4 minggu setelah tanam MST.
Dari hasil pengamatan diperoleh 25 eksplan tumih yang masih tetap bertahan, 21 eksplan mengalami pencokelatan browning dan 66 eksplan yang mengalami
kontaminasi. Dari hasil pengamatan diperoleh hasil kontaminasi lebih tinggi dibandingkan eksplan yang masih tetap bertahan hidup. Hasil pengamatan dapat
dilihat lebih jelas pada Tabel 5. Tabel 5 Data eksplan tumih yang memiliki peluang hidup hingga 4 MST
Ulangan Perlakuan
A0 B0
A0 B1
A0 B2
A0 B3
A1 B0
A1 B1
A1 B2
A1 B3
A2 B0
A2 B1
A2 B2
A2 B3
A3 B0
A3 B1
A3 B2
A3 B3
1 -
br br
- br
- br
- br
br -
- -
br -
- 2
- -
- -
- -
- -
v br
- -
- v
br -
3 v
- -
v -
- -
- -
- -
- -
br v
- 4
v -
- -
- -
br -
- -
- br
- v
- -
5 -
br br
v -
br v
br v
- -
- br
v -
br 6
v v
- v
v v
v v
- -
v br
- -
v -
7 v
- -
br v
- -
- -
v -
br v
v -
-
Total 4
1 -
3 2
1 2
1 2
1 1
- 1
4 2
-
Keterangan : v
= bertahan 25 eksplan br = browning 21 eksplan
- = kontaminasi 66 eksplan
Data dari Tabel 6 menunjukkan persentase peluang hidup eksplan tumih pada masing-masing jenis media perlakuan. Persentase peluang hidup eksplan
tumih pada perlakuan A0B0 dan A3B1 memiliki persentase peluang hidup paling tinggi. Sementara itu persentase peluang hidup terendah terdapat pada perlakuan
A0B1, A1B1, A1B3, A2B1, A2B2 dan A3B0 sehingga diperoleh rata-rata hasil persentase peluang hidup 22,32.
Tabel 6 Persentase peluang hidup eksplan tumih
Perlakuan Rata-
rata A0
B0 A0
B1 A0
B2 A0
B3 A1
B0 A1
B1 A1
B2 A1
B3 A2
B0 A2
B1 A2
B2 A2
B3 A3
B0 A3
B1 A3
B2 A3
B3
peluang hidup
57. 14
14. 29
- 42.
86 28.
57 14.
29 28.
57 14.
29 28.
57 14.
29 14.
29 -
14. 29
57. 14
28. 57
- 22.32